食品中丙烯酰胺的测定及其含量控制方法

◎ 石声鑫

（汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515041）

食品中丙烯酰胺的测定及其含量控制方法

◎ 石声鑫

（汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515041）

建立一种准确、方便的检测食品中丙烯酰胺含量的高效液相色谱分析方法。样品中的丙烯酰胺经丙酮提取后，以甲醇-水溶液（5∶95）为流动相，C18色谱柱分离，二极管阵列检测器检测，检测波长为210 nm，外标法定量。结果显示，方法线性良好，检出限为5 ng/g，RSD为0.53%～2.10%，回收率为86.3%～101.5%。运用该检测方法，进一步探索减少食品中丙烯酰胺产生的措施，结果表明，将薯条油炸温度降到180 ℃和在其原料中添加VC、纤维素可有效控制丙烯酰胺的产生，其中添加纤维素的效果明显。

高效液相色谱；丙烯酰胺；食品；控制

丙烯酰胺是一种水溶性的塑胶单体化合物，是生产聚丙烯酰胺的原料。自2002年我国在油炸和烧烤的淀粉类食品首次检出丙烯酰胺，其他国家也相继报道类似结果[1,2]。目前，大部分学者认为丙烯酰胺的生成是天冬酰胺或谷氨酸等相似结构的氨基酸及葡萄糖等经过高温加热所致。丙烯酰胺具有潜在的致癌性、神经毒性、遗传毒性和生殖毒性[3,4]，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺，在人体内，丙烯酰胺生成活性环氧丙酰胺，这种物质容易与DNA结合，形成络合物，导致细胞内遗传物质损伤和基因突变。

丙烯酰胺的毒性引起全球研究人员的极大关注。①关于食品中丙烯酰胺含量的分析方法的研究。目前，食品中丙烯酰胺的检测，国际上使用最多的方法有GC-MS法、LC-MS法、LC-MS-MS法等。我国制定的食品中丙烯酰胺检测的标准有两部[5,6]。大部分分析方法均需要经过样品脱脂净化，加入同位素标记的丙烯酰胺作为内标，样品溴化衍生等步骤，过程繁琐，被测组分在前处理过程损失较大，回收率低且测定误差较大。②关于食品中丙烯酰胺含量控制的研究。我国是以粮谷类食物为主的国家，因此，建立食品中丙烯酰胺的快速准确检测技术，探索其减少措施具有积极的现实意义。本课题拟采用HPLC-DAD研究食品中丙烯酰胺的测定方法，优化前处理步骤和仪器分析条件，以建立食品中丙烯酰胺的快速准确检测技术，并且从原料、生产工艺等方面研究，探索减少丙烯酰胺产生的措施。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Agilent1200高效液相色谱仪：Agilent1200型，配有二极管阵列检测器DAD，美国Agilent公司；超声波水浴器：英国GRANT XUB18；有机相滤膜：13 mm×0.22 μm，津腾仪器有限公司；甲醇、丙酮：色谱纯；乙酸：分析纯；丙烯酰胺：纯度≥99.0%，250 mg，美国Sigma公司；丙烯酰胺标准储备液：取10 mg丙烯酰胺（精确至0.1 mg），用甲醇溶解后定容于100 mL的棕色容量瓶中，配制成浓度为100 μg/mL丙烯酰胺的标准储备液，贮存于-20 ℃冰箱中，使用时用水稀释成标准工作溶液。

1.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.5 mL/min；柱温30 ℃；进样量为10 μL。设置3种体积配比的流动相条件，甲醇-水溶液（A：5∶95，B：20∶80，C：60∶40）进行试验，考察丙烯酰胺的标准溶液的色谱图效果。

1.3 实验方法

（1）标准曲线的制备。将标准贮备液用纯水稀释配制成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的标准工作溶液，进液相色谱分析，以各标准峰的保留时间定性，峰面积外标法定量，绘制标准曲线。

（2）样品前处理方法的优化。分别用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作为提取溶剂：分别称取5份5 g（精确至0.01 g）均质加标（加标量为2 μL）薯条样品于10 mL容量瓶中，分别加入不同提取溶剂并定容至10 mL，加塞涡旋5 min后置于超声波水浴中处理30 min，经滤膜过滤后，进样测定。

（3）精密度和加标回收率测定。选取曲奇、面包、薯条三种样品，进行3水平添加回收试验，每个添加水平取6个平行样，进行回收率试验。

（4）方法最低检出限。选取空白样品添加标准溶液，适当稀释样品的浓度，使其信噪比RSN≤3时样品的浓度为方法的最低检出限。

（5）控制丙烯酰胺含量的方法。选取未油炸的薯条样品，将样品分为9组，每组4个样品，检测每个样品，根据检测结果比较各组差异。具体工艺改进方法如下：①正常的油炸油温为220 ℃左右，将油温降至180 ℃左右和200 ℃左右。②两组样品中分别添加0.05 g/kg和0.1 g/kg的特丁基对苯二酚（TBHQ），经正常油温煎炸。③两组样品中分别添加0.2 g/kg和0.4 g/kg的维生素C（VC），经正常油温煎炸。④两组样品中分别添加0.5%纤维素和1.0%纤维素，经正常油温煎炸。比较4组成品中丙烯酰胺的含量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长和流动相比例的选择

由于试样中杂峰较多，易产生假阳性，本文取丙烯酰胺浓度为0.2 μg/mL的溶液，利用DAD检测器对其进行紫外190～400 nm全波长扫描，确定210 nm为测定波长，360 nm为参比波长，便于筛除干扰物质，初步定性待测组分后进一步定量，从而提了检测的灵敏度，丙烯酰胺的吸收光谱如图1所示。

图1 丙烯酰胺的吸收光谱图

改变流动相比例，分别对甲醇-水溶液按不同比例（A：5∶95，B：20∶80，C：60∶40）试验。结果表明，流动相为甲醇-水溶液（5∶95）时，峰形对称，重现型最好，效果最好（色谱图如图2所示）。

图2 0.4 μg/mL丙烯酰胺标准溶液在A流动相比例下的高效液相色谱图

2.2 线性关系

将浓度为0.02、0.1、0.2、0.4 μg/mL和1.0 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液，在规定的色谱条件下测定，标准溶液所得的色谱峰峰面积和对应的浓度绘制成标准曲线，得到的标准曲线如图3所示。

图3 丙烯酰胺标准溶液标准曲线图

测定结果表明，在0.05～1.0 μg/mL的浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，符合定量要求。

2.3 样品前处理方法的优化

分别采用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作为提取溶剂对加标样品进行前处理，测定其回收率。丙烯酰胺是极性小分子物质且在酸性溶液中更加稳定，采用水或极性强的有机溶剂萃取，在基质复杂的食品中更好地提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺。结果见表1，加标回收试验显示4种溶剂均能达到90%以上，满足检测要求，尤以丙酮作为提取溶剂时提取效果最好，回收率达97%，同时在液相色谱上也有很好的分离。

表1 4种不同提取溶剂的回收率表（单位：%）

2.4 精密度、加标回收率和最低检出限

选取曲奇、面包、薯条3种样品进行3水平添加回收试验，每个添加水平取6个平行样，应用优化后的方法进行回收率试验，结果见表2。未加标的薯条样品色谱图和对应的加标色谱图如图4、图5所示。该方法回收率为86.3%～101.5%，相对标准偏差为0.83%～2.15%，精密度较高。准确度和精密度符合丙烯酰胺的检测要求。

选取空白饼干样品添加丙烯酰胺，将含量依次降低的丙烯酰胺加入到样品中去，对每个浓度样品测定3次，记录每次测得S/N值，结果显示当添加5 ng/g时，S/N=3.1，因此该方法检出限为5 ng/g。检出限比国家标准方法的更低[5]，符合新的检测要求。

表2 样品添加不同浓度丙烯酰胺标样的回收率及相对标准偏差表（单位：%）

图4 未加标的薯条样品色谱图

图5 加标的薯条样品色谱图

2.5 不同工艺条件丙烯酰胺的含量水平

按优化的丙烯酰胺检测方法，分别对不同工艺条件下成品薯条样品的丙烯酰胺含量进行检测，结果见表3。与正常组相比，在200 ℃时变化不大；而添加TBHQ后，丙烯酰胺含量反而有所增加；油温降至180 ℃时、添加VC以及纤维素丙烯酰胺含量控制效果明显，其中以1.0%纤维素添加量效果最优，丙烯酰胺含量仅为正常组的28%。

表3 不同工艺条件下成品薯条丙烯酰胺的含量表

3 结果和讨论

丙烯酰胺是极性小分子物质，可用水或极性强的有机溶剂萃取。丙烯酰胺在酸性溶液中更加稳定，但考虑到食品基质复杂，本研究分别采用水、0.1%乙酸溶液、丙酮、5%甲醇溶液作为提取溶剂对样品进行前处理。结果表明，4种溶剂均可较好地提取丙烯酰胺，均能满足检测要求，尤以丙酮作为提取溶剂时提取效果最好，可能是由于丙酮能更好地提取包埋在脂肪微粒中的丙烯酰胺。此前处理方法方便快捷，相比国家标准采用的气质联用法（GC-MS）和国际上使用的液质联用法（LC-MS-MS），样品前处理需经过净化、溴化衍生等步骤，可避免繁琐步骤造成的成分损失，确保较高的回收率。HPLC方法操作简便，更易于推广，采用甲醇-水溶液（5∶95）作为流动相，丙烯酰胺有很好的分离效果，峰形完好，峰的保留时间和重现性均良好。从精密度、回收率和最低检出限试验中表明，该检测方法灵敏度、精密度和准确度均较高，符合检测要求。试验证明该方法是一种准确、方便的测定食品中丙烯酰胺的分析方法。

在探索工艺方法控制食品中丙烯酰胺产生时，主要从温度和抗氧化两个方面考虑。通过将油温降至180 ℃，成功地减少丙烯酰胺的产生，但在200 ℃时则无变化。从感官上看，与正常油温炸出的薯条相比，180 ℃时颜色略淡，体积略小，口味则无大变化。因此，通过适当的降低加工温度可减少丙烯酰胺的产生，这也与文献研究结果一致[7]，但不同的原料产品有不同的最佳加工温度，这需要不断地探索。原料添加TBHQ和VC后感官基本无影响，TBHQ的使用符合GB 2760-2011标准添允许的最大添加量[8]，但在使用TBHQ后对丙烯酰胺的抑制并不明显，甚至有促进趋势，这可能是高温使抗氧化剂TBHQ发生反应，丧失抗氧化活性，或反应生产一种有利于丙烯酰胺生成的中间物质；纤维素则对丙烯酰胺抑制效果明显，且纤维素添加量越高，抑制效果越明显，纤维素对丙烯酰胺产生的抑制机理可能是由于纤维素的添加可大大降低吸油率，减少裹粉中的油脂含量，增加裹粉的水分含量，因此在油炸过程中，水分被油脂置换受到限制，产生丙烯酰胺的褐变反应受到抑制。

4 结语

本研究结果表明，控制薯条油炸油温在180 ℃和在原料中添加VC、纤维素可有效减少成品丙烯酰胺产生，但丙烯酰胺的产生是一个复杂的过程，其影响因素不仅与加工温度和各种添加剂有关，还与加工时间、pH值、含水量、原料内在成分和油的使用时间等的因素有关，值得进一步研究。

[1]Tareke E，Rydberg P，Karlsson P，et al. Analysis of acrylamide，a carcinogen formed in heated foodstuffs[J]. Journal of agricultural and food chemistry，2002（17）：4998-5006.

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[4]Sanders RA，Zyzak DV，Stojanovic M，et al. The 116thAOAC international annual meeting & exposition[R].Los Angeles，CA，USA，Noabstract available，2002.

[5]国家卫生和计划生育委员会.GB/T 5009.204-2014 食品安全国家标准 食品中丙烯酰胺的测定[S].北京：中国标准出版社，2014.

[6]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 2096-2008 食品中丙烯酰胺的检测方法 同位素内标法[S].北京：中国标准出版社，2008.

[7]Williams JSE. Influence of variety and processing conditions on acrylamide levels infried potato crisps [J]. Food Chemistry，2005（4）：875-881.

[8]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 2760-2014 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准[S].北京：中国标准出版社，2014.

Determination and the Control Methods of Acrylamide in Food

Shi Shengxin
(Shantou Supervison Testing Institute of Quality and Metrology, Shantou 515041, China)

An accurate and convenient method for the determination of acrylamide in food by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. The acrylamide was extracted with acetone and separated by a C18column with methanol - water (5∶95) as the mobile phase. The detection wavelength was set at 210 nm with a diode array detector and quantifed by external standard method. The detection limit was 5 ng/g, RSD was 0.53%～2.10%, and the recovery was 86.3%～101.5%. The results showed that the frying temperature of french fries was reduced to 180 ℃ and the addition of VC and cellulose in the raw materials could efectively control the production of acrylamide, and the addition of fber the efect is obvious.

HPLC; Acrylamide; Food; Control

O657.7

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.24.049