FAM46A、EBF1基因多态性与河南汉族肺结核相关性分析

王骑凤，肖　海，杨洪毅，雷冬梅

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 450001　2)河南省人民医院医学遗传研究所 郑州 450003

3)郑州大学第一附属医院生殖医学中心 郑州 450052　4)郑州大学第三附属医院病理科 郑州 450052



FAM46A、EBF1基因多态性与河南汉族肺结核相关性分析

王骑凤1)，肖海2)，杨洪毅3)，雷冬梅4)#

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室 郑州 4500012)河南省人民医院医学遗传研究所 郑州 450003

3)郑州大学第一附属医院生殖医学中心 郑州 4500524)郑州大学第三附属医院病理科 郑州 450052

关键词肺结核；FAM46A基因；EBF1基因；多态性；河南汉族

摘要目的：探讨FAM46A基因VNTR位点和EBF1基因rs10515787位点多态性与河南汉族人群肺结核易感性的关系。方法：抽取河南汉族200例肺结核患者和200名健康人的外周血，采用短串联重复PCR扩增结合毛细管电泳方法检测FAM46A基因VNTR位点多态性，PCR-RFLP方法检测EBF1基因rs10515787位点多态性。结果：在河南汉族人群中发现FAM46A基因VNTR位点存在4种等位基因、9种基因型。EBF1基因rs10515787位点存在2种等位基因、3种基因型。2组比较，VNTR位点2、3等位基因频率差异有统计学意义(P均<0.001)，2/2、2/3基因型频率差异有统计学意义(P均<0.05);rs10515787位点等位基因频率差异有统计学意义(P=0.001)，AA基因型频率差异有统计学意义(P=0.004)。结论：FAM46A基因VNTR位点和EBF1基因rs10515787位点多态性与河南汉族肺结核的易感性有关。

AbstractAim: To explore the associations between VNTR loci in the FAM46A gene and rs10515787 loci in the EBF1 gene and susceptibility of pulmonary tuberculosis in Henan Han population.Methods: The methods of STR-PCR-CE was used to detect the polymorphism of VNTR loci in the FAM46A gene, and PCR-RFLP to detect polymorphism of rs10515787 loci in the EBF1 gene in 200 cases of pulmonary tuberculosis and 200 cases of healthy people of Henan Han population.Results: Four kinds of alleles and nine kinds of genotypes of VNTR loci in the FAM46A gene were detected. Comparison between pulmonary tuberculosis group and control group respectively，the differences of allele 2 and 3 of VNTR were significant(P<0.001),the differences of 2/2 and 2/3 genotypes were significant(P<0.05),the difference of alleles in rs10515787 was significant(P=0.001), and the difference of AA genotype was significant(P=0.004).Conclusion: The VNTR loci in FAM46A gene and rs10515787 loci in EBF1 gene polymorphisms are associated with the susceptibility of pulmonary tuberculosis in Henan Han population.

蛋白序列相似度为46的类细胞因子A(family with sequence similarity 46, member A,FAM46A)基因位于6q14.1，其第2外显子处存在一个VNTR序列[1]，VNTR序列变异可能引起多种疾病[1-2]。研究[1]发现，该位点多态性与肺结核的易感性相关，并可能通过调控基因转录导致人类多种疾病[3-4]。早期B细胞因子1(early B cell factor 1，EBF1)是B细胞发育必要的转录因子，据报道[5]，EBF1基因的rs10515787位点多态性与印第安人肺结核易感性相关。作者分析了FAM46A基因的VNTR位点、EBF1基因的rs10515787位点多态性与河南汉族人群肺结核易感性的相关性，为探讨肺结核的发病机制，制定有效的预防、诊断和治疗方法提供理论依据。

1对象与方法

1.1研究对象病例组：选择200例初诊肺结核患者，年龄20～56(38.9±17.6)岁，其中男146例，女54例，肺结核的诊断参考2008年我国卫生部制定的WS 288-2008诊断标准；排除其他免疫性疾病、感染性疾病(如糖尿病、HIV感染等)患者以及使用免疫抑制剂的患者。对照组：选取200名同期体检的健康个体，年龄20～52(36.0±15.7)岁，其中男178例，女22例；排除标准同病例组。

所有病例组和对照组的研究对象均来自2012年至2013年河南省安阳和新乡传染病医院，研究对象之间无血缘关系，均为汉族。所有研究对象对该研究均知情同意。

1.2PCR扩增与电泳抽取研究对象2 mL外周血，酚-氯仿法提取基因组DNA。引物序列根据GenBank用Primer Premier 5.0设计(表1)。

表1　VNTR、 rs10515787

VNTR位点的PCR反应体系为26 μL：DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 2 μL，5 U/μL 的Taq 酶0.2 μL，去离子水17.8 μL。rs10515787位点的PCR 反应体系为20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去离子水7 μL。PCR反应条件见表2。PCR产物毛细管电泳由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。两位点均取扩增产物10 μL，加入10×Buffer 2 μL、TasⅠ内切酶1 μL、去离子水18 μL，65 ℃水浴锅中酶切1 h，20 g/L琼脂糖凝胶电泳1 h，紫外凝胶成像分析仪下观察并记录电泳结果。以上两位点电泳结果均经测序进行验证。

表2　两位点PCR反应条件

1.3基因型判定内侧引物扩增VNTR位点产物经电泳后得到4种片段，分别为171、156、141、126 bp，与GenBank比对，根据其荧光值，171 bp片段为4次重复(即等位基因4)，156 bp片段为3次重复(即等位基因3)，141 bp片段为2次重复(即等位基因2)，126 bp片段为1次重复(即等位基因1)。

EBF1基因rs10515787位点扩增产物大小为290 bp，该片段除多态性位点外，还有一个非多态性酶切位点，用限制性内切酶TasⅠ酶切后得到3种片段：AA基因型，189、69、32 bp；GG基因型，221、69 bp；AG基因型，221、189、69、32 bp。

1.4统计学处理采用HWE 1.20检测对照组是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用SPSS 17.0进行统计学处理,采用χ2检验或精确概率法比较2组间等位基因频率和基因型频率的差异，并计算OR及95%CI[6]来评估所检测的基因多态性与肺结核的相关性，检验水准α=0.05。

2结果

2.1FAM46A基因VNTR位点多态性的检测结果在所有研究对象中，检测到FAM46A基因VNTR位点的4种等位基因(1、2、3、4)，9种基因型(1/1、1/2、2/2、1/3、2/3、3/3、2/4、3/4、4/4)，对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.953，P=0.428)。每种基因型的测序结果与电泳结果一致。VNTR位点等位基因和基因型频率在2组间的分布见表3。

2.2EBF1基因rs10515787位点多态性的检测结果EBF1基因rs10515787位点经酶切、电泳后，检测到2种等位基因G、A，3种基因型GG、GA、AA(图1)，对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.724,P=0.394)。每种基因型的测序结果与电泳结果一致。rs10515787位点等位基因和基因型频率在2组间的分布见表4，不同遗传模式下该位点在2组间的基因型分布见表5。

表3　FAM46A基因VNTR位点

*：精确概率法。

1～3：分别为GA、GG和AA基因型；4：空白对照；M：Marker。图1　EBF1基因rs10515787各基因型电泳图

表4　EBF1基因rs10515787位点

表5　3种遗传模式下rs10515787

3讨论

肺结核是一种人畜共患的慢性传染病，严重损害肺组织的结构和功能[7-9]。该病的发病机制非常复杂，除了受病原体毒力和环境因素的影响外，其发生还与宿主遗传因素有关[10]。

FAM46A基因位于6q14.1，全长约6 982 bp，包含3个外显子。FAM46A基因编码的序列是一个突变体，全长约5 609 bp，编码442个氨基酸，VNTR位点位于FAM46A基因编码区的第2外显子处。该研究在所有研究对象中均检测到VNTR位点的4种等位基因及9种基因型，发现病例组2等位基因、2/2基因型频率高于对照组，表明2等位基因、2/2基因型可能会增加肺结核的发病风险，是一种肺结核发生的风险因子；对照组3等位基因、2/3基因型频率高于病例组，表明3等位基因、2/3基因型可能会降低肺结核的发病风险，是肺结核发生的保护因子；2组间3/3基因型频率比较，差异无统计学意义，还有待于进一步的研究。该研究结果与以往的研究[1，11]结果不一致。Etokebe等[1]在克罗地亚人群的257例肺结核患者和450名健康人中，共检测出了6种等位基因和19种基因型，其中3/3基因型可能是肺结核发生的遗传危险因子。Cui等[11]在浙江杭州122例结直肠癌患者和266名健康人FAM46A基因VNTR位点中检测出了3种等位基因和6种基因型。以上结果表明，FAM46A基因VNTR位点表现出明显的地域和种族差异，提示该位点对肺结核易感性的影响亦可能具有种族和地域性差异，因此对肺结核的预防和治疗方案应针对具体的人群来制定。

EBF1基因在B细胞分化成熟中发挥着重要作用。rs10515787位点位于EBF1基因的内含子区域，参与多种调控作用。该研究结果显示，EBF1基因rs10515787位点多态性与肺结核的易感性有关，且AA基因型及A等位基因可能是河南汉族肺结核发生的危险因子，该结果与以往研究[5]结果一致。该研究结果提示，EBF1基因可能是肺结核易感性的候选基因，其调控机制以及地域和种族差异有待进一步研究。

参考文献

[1]ETOKEBE GE,BULAT-KARDUM L,MUNTHE LA,et al.Association of variable number of tandem repeats in the coding region of the FAM46A gene, FAM46A rs11040 SNP and BAG6 rs3117582 SNP with susceptibility to tuberculosis[J].PLoS One,2014,9(3):e91385

[2]李涛,尚迎辉,白峻瑜,等.河南汉族动脉硬化性脑梗死人群血小板膜糖蛋白Iba基因VNTR多态性检测[J].郑州大学学报(医学版),2012,47(4):466

[3]HANNAN AJ.TRPing up the genome:tandem repeat polymorphisms as dynamic sources of genetic variability in health and disease[J].Discov Med,2010,10(53):314

[4]HANNAN AJ.Tandem repeat polymorphisms: modulators of disease susceptibility and candidates for missing heritability[J].Trends Genet,2010,26(2):59

[5]PNG E, ALISJAHBANA B, SAHIRATMADJA E, et al.A genome wide association study of pulmonary tuberculosis susceptibility in Indonesians[J].BMC Med Genet,2012,13：5

[6]SHI YY,HE L.SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci[J].Cell Res,2005,15(2):97

[7]劳穗华,王娟,俞朝贤,等.肺结核并重症肺炎行有创机械通气患者下呼吸道病原菌分布及耐药性特点[J].南方医科大学学报,2014,34(8):1192

[8]DYE C,SCHEELE S,DOLIN P,et al.Consensus statement. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project[J].JAMA,1999,282(7):677

[9]VAN LETH F,VAN DER WERF MJ,BORGDORFF MW.Prevalence of tuberculous infection and incidence of tuberculosis:a re-assessment of the Styblo rule[J].Bull World Health Organ,2008,86(1):20

[10]肖海,杨洪毅,张照婧,等.河南汉族肺结核患者PTPN22基因多态性检测[J].郑州大学学报(医学版),2013,48(2):207

[11]CUI J,WANG W,LAI MD,et al.Identification of a novel VNTR polymorphism in C6orf37 and its association with colorectal cancer risk in Chinese population[J].Clin Chim Acta,2006,368(1/2):155

*国家自然科学基金资助项目81160157

Analysis of associations between FAM46A and EBF1 gene polymorphisms and pulmonary tuberculosis in Henan Han population

WANGQifeng1),XIAOHai2),YANGHongyi3),LEIDongmei4)

1)DepartmentofCellBiologyandMedicalGenetics,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)MedicalGeneticsInstitute,HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou4500033)ReproductiveMedicalCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

4)DepartmentofPathology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordspulmonary tuberculosis;FAM46A gene;EBF1 gene;polymorphism;Henan Han population

中图分类号R394

通信作者#，女，1972年2月生，硕士，副教授，研究方向：遗传病理学，E-mail:leidongmei26@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.014 10.13705/j.issn.1671-6825.2016.01.015