膜联蛋白A2对人结肠癌细胞SW620侵袭迁移的影响*

蒋 丽，张桂英, 张晓梅, 李 辉， 穆仪冰

(1.湖南省长沙市第四医院消化内科， 长沙 410006； 2.中南大学湘雅医院消化内科， 长沙 410008)

膜联蛋白A2对人结肠癌细胞SW620侵袭迁移的影响*

蒋 丽1，张桂英2, 张晓梅2, 李 辉1， 穆仪冰1

(1.湖南省长沙市第四医院消化内科， 长沙 410006； 2.中南大学湘雅医院消化内科， 长沙 410008)

目的：研究膜联蛋白A2(ANXA2)对人结肠癌细胞SW620侵袭迁移的影响。方法: 采用siRNA技术沉默ANXA2在SW620细胞中的表达，实验分为干扰组、对照组和野生组，RT-PCR法检测各组ANXA2 mRNA水平，Western blot法检测各组ANXA2、纤维蛋白溶酶(PL)、基质金属蛋白酶- 1(MMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达，Transwell侵袭实验检测各组SW620细胞穿膜能力。结果: 干扰组与对照组、野生组相比，ANXA2 mRNA水平、ANXA2、PL、MMP-1、VEGF蛋白表达及SW620穿膜细胞数差异均有统计学意义(P<0.05)，而对照组和野生组相比上述各指标均无统计学差异。ANXA2蛋白和PL、MMP-1、VEGF蛋白水平、穿膜细胞数呈正相关(P<0.05)。结论: 沉默ANXA2基因后可能通过下调PL、MMP-1及VEGF蛋白的表达，抑制SW620细胞侵袭迁移能力起到抗肿瘤作用。

膜联蛋白A2； 结肠癌； 纤维蛋白溶酶； 基质金属蛋白酶-1； 血管内皮生长因子

结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤，随着诊治技术的提高预后大大改进，但其侵袭转移仍是一大棘手问题[1]。已有研究表明[2-3]膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)在结肠癌中过表达与肿瘤的进展密切相关。但这些研究大部分属回顾性病理资料报道，因果关系及具体作用机制不明确。小分子干扰RNA片段(small interfering RNA，siRNA)技术[4-6]通过转录后基因沉默作用，揭示出靶基因的可能作用机制，是目前研究基因功能的较好方法。本研究选用高转移性人结肠癌细胞系SW620[7-8]，采用siRNA技术沉默该细胞系ANXA2的表达，研究其对下游纤维蛋白溶酶(plasmin，PL)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表达的影响，以及对SW620细胞侵袭迁移的影响，为探讨其在结肠癌发展过程中的可能机制及应用于基因靶向治疗的可行性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞系SW620购自中南大学湘雅医学院肿瘤研究所分子遗传室；百奥生物技术(南通)有限公司构建合成人ANXA2基因的干扰序列和错义对照序列[3-6]。靶向siRNA(siANXA2)序列：TGTGTGGTGGAGATGACTGA，错义对照siRNA(siRNASCR)序列：GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC。经BLAST同源性分析，确认与人类其它基因序列无同源性。

实验试剂 RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；链霉素、青霉素、庆大霉素及胰蛋白酶购自西安沃尔森公司；Endo-free Plasmid Mini Kit II试剂盒购自Omega公司，siRNA转染试剂购自美国OriGene公司。兔抗人ANXA2单抗(ab41803)、PL多抗(ab48350)、MMP-1单抗(ab194228)、VEGF单抗(ab52917)、兔抗人β-actin单抗(ab8226)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗(ab131366)均购自美国Abcam公司，Western blot试剂盒(WB0411)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。Trizol试剂和逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，BD Matrigel基质胶(356234)购自北京美科美佳生物科技有限公司，Transwell小室(3428型)购自北京明阳科华生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒制备 质粒pU6H1-GFP-siANXA2和pU6H1-GFP-siRNASCR的制备参照Endo-free Plasmid Mini Kit II说明书进行。将合成的靶向人ANXA2的干扰序列和错义对照序列分别克隆至含有GFP报告基因的pU6H1载体(pU6H1-GFP)，将重组质粒转化于感受态大肠杆菌DH5α，-80℃储存。

1.2.2 细胞培养和转染 SW620细胞以RPMI1640完全培养基(含10%胎牛血清、100μg/mL链霉素、100μg/mL庆大霉素、100μg/mL青霉素)于37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养，转染前一天将对数生长期细胞消化，重悬于无血清、无抗生素的RPMI1640培养基中，以2×105细胞/孔接种于6孔培养板中，待细胞生长达50%～70%融合度时再行转染。实验分3组，将质粒pU6H1-GFP-siANXA2(干扰组)和pU6H1-GFP-siRNASCR(对照组)细胞转染以每孔4μg的用量导入细胞内。具体操作参照siRNA转染试剂说明书进行。同时设野生组(以PBS代替质粒用量)。每组设2个复孔。转染后6h更换培基，以后每24h更换一次培基。转染60h后，400倍倒置显微镜下随机选取5个视野计数绿色荧光细胞数及总细胞数，转染效率=(绿色荧光细胞数/总细胞数)×100%。

1.2.3 ANXA2 mRNA检测[9]于转染后48h收集各组细胞，Trizol试剂提取总RNA，点样时设3个复孔，琼脂糖电泳分析其完整性，按逆转录试剂盒说明书将细胞的总RNA逆转录成cDNA，以β-actin为内参，RT-PCR扩增引物序列如下所示：ANXA2上游：5’-TGAGCGGGATGCTTTGAAC-3’，下游：5’-ATCCTGTCTCTGTGCATTGCTG-3’，505bp；β-actin上游：5’-ATTGCCGACAGGATGCAGA-3’，下游：5’-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’，580bp。反应条件：95℃，2min，94℃，15s，58℃，30s，72℃，1.5min；30个循环，72℃；10min。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪拍照，计算ANXA2与内参平均吸光度(A)值，以两者吸光度比值作为目的基因相对表达量。

1.2.4 Western blot法[10]检测ANXA2、PL、MMP-1、VEGF蛋白表达水平 于转染后48h取出培养瓶，弃培基，Hanks液洗涤细胞3次，吸尽残液，将培养瓶置于冰上，加入细胞裂解液制成匀浆液，高速离心后取上清液与上样缓冲液混匀加热后置入-20℃冰箱中保存。先后灌制分离胶和积层胶，加电泳缓冲液后上样，电泳完毕后将蛋白转印于硝酸纤维素膜上。脱脂奶粉封闭膜后加入一抗，4℃过夜，洗膜，加二抗。洗膜后加入免疫印迹化学发光试剂(ECL)，显影、洗片、晾干。凝胶图像分析仪扫描照片。实验重复3次，选择无杂带、条带最清晰组为最终结果，经图像处理系统测定各组蛋白表达量(条带灰度值)与内参(β-actin)表达量的比值，以此作为各蛋白相对表达量。

1.2.5 Transwell侵袭实验[10]将冻存于-80℃冰箱的BD Matrigel 基质胶4℃过夜(24h)变成液态；将Matrigel基质胶与无血清培养基以1:2的比例配置后混匀，向Transwell上室中加入15μl稀释后的基质胶后包被Transwell小室底部膜的上室面，37℃孵育30～60min使其聚合成凝胶。将三组细胞撤血清继续培养12～24h，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，PBS洗2遍，用无血清培养基重悬细胞并使用细胞计数仪计数，重复3次，保证各组细胞密度一致。向Transwell小室中加入200μl悬液，使种板时每孔上室细胞数为1.5×105个，下室加入含15%FBS的培养基500μl，放至培养箱内孵育24h。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗2遍，4%多聚甲醛溶液固定8～10min，将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20min，PBS洗2遍,用棉签轻轻擦掉基质胶和上层未迁移细胞，400倍倒置显微镜下随机选取5个视野计数穿膜细胞数。

1.2.6 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件，所有变量均以表示。计量资料比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及独立样本t检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒转染效率评估

PU6H1-GFP-siANXA2质粒转染SW620细胞60h后，倒置显微镜观察计算，转染效率约为85.6%，提示转染效果可。见图1。

图1 pU6H1-GFP-siANXA2质粒转染SW620细胞 ×400

2.2 三组细胞各检测指标比较

干扰组较对照组和野生组相比ANXA2 mRNA水平降低(见图2)、ANXA2、PL、MMP-1及VEGF蛋白表达均下降(见图3)，SW620穿膜细胞数减少(详见图4)。三组细胞各项指标相比差异均有统计学意义，P<0.05；干扰组与对照组及干扰组与野生组上述各指标比较，差异均有统计学意义，P<0.05；对照组与野生组上述各指标比较，差异无统计学意义，P>0.05(详见表1)。

图2 RT-PCR检测ANXA2 mRNA表达

图3 Western blot检测ANXA2、PL、MMP-1VEGF的表达

图4 Transwell基质胶侵袭实验 结晶紫染色×400

(1.干扰组 2.对照组3.野生组)

注：*P≤0.05

2.3 Spearman秩相关分析

ANXA2蛋白变化和PL、MMP-1、VEGF蛋白水平、穿膜细胞数变化呈正相关关系，均P<0.05(详见图5)。

图5 ANXA2蛋白与相关指标的Spearman秩相关分析

3 讨 论

ANXA2属于膜联蛋白家族成员，以单体、异源二聚体和异源四聚体三种形式存在于胞核、胞浆及细胞表面[2-3,11-12]。在正常结肠黏膜细胞中ANXA2参与生物膜结构域的建立与稳定、胞膜运输、离子通道的形成、信号转导、细胞增殖、分化及凋亡等一系列重要的生物学功能，在增生和转化的细胞呈高表达，在终末和分化细胞呈低表达。研究提示ANXA2在肿瘤尤其是高侵袭性肿瘤中表达增高，如Tristante等通过免疫组化染色显示结肠癌中ANXA2表达阳性率明显高于正常结肠黏膜，与肿瘤组织分型、体积、分期、淋巴结转移及脉管侵犯有关[11,13]。但ANXA2究竟通过什么机制参与肿瘤发展，沉默其表达是否对改善肿瘤预后有效？有报道[10,14-15]ANXA2在细胞表面可作为纤维蛋白溶酶原(plasminogen，PLG)和组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,T-PA)的共同受体，以异四聚体形式结合T-PA和PLG，在内皮细胞表面共区域化促使PLG蛋白水解, 生成纤维蛋白溶酶(PL)。奉艳等[3]采用siRNA技术下调结直肠癌 CACO2 细胞ANXA2表达，T-PA及PL表达随之下降，提示PL为ANXA2下游靶点之一。PL是一种丝氨酸蛋白酶，可激活基质金属蛋白酶(MMPs) ，尤其是MMP-1活化，可导致膜蛋白的水解、细胞外基质(ECM)的降解等[16], 进而使ECM及血管外周基膜降解，造成肿瘤细胞易出血和转移。Qi等[17]报道ANXA2通过激活PL促进各种生长因子的活化，如提高血管内皮生长因子(VEGF)的生物学效率。VEGF已知可强烈诱导血管生长，其表达水平与肿瘤内血管生长情况及转移风险呈正相关[18]。纵观国内外文献研究，均提示ANXA2为与晚期肿瘤侵袭转移信号通路高度相关的潜在靶标，但已有报道均为零散片段研究，并无通过沉默其表达以致干扰下游靶点来影响肿瘤进展的序贯系统研究。

本研究选用高转移性结肠癌细胞系SW620，采用siRNA技术沉默其ANXA2的表达，研究其对下游靶点PL、MMP-1及VEGF蛋白表达影响及对肿瘤细胞侵袭迁移的影响，试图探讨其对结肠癌发展整条相关信号通路的影响，较已有研究因果性、特异性更强，探讨更全面，试图揭示验证ANXA2在结肠癌中可能作用机制及后续靶向治疗的可行性。在研究中选用带GFP基因的双启动子表达质粒载体pU6H1-GFP，其启动子U6和H1位于插入点两侧，形成功能性的siRNA片段，转染效率约为85.6%，提示效率较高。siRNA技术沉默ANXA2基因后，其mRNA及蛋白表达水平较对照组及野生组均下降，提示干扰成功。与其他两组相比，干扰组因ANXA2被沉默，其下游PL、MMP-1及VEGF蛋白表达均下降，SW620细胞穿膜能力减弱，且ANXA2蛋白与上述指标呈正相关，提示下调ANXA2后其下游一系列靶点蛋白相应出现表达变化、癌细胞的侵袭迁移功能也随之改变。而对照组和野生组因ANXA2未被干扰，不影响其发挥作用，上述指标相比差异无统计学意义。本研究与已有研究报道[3，10，14-18]相比，除结果相一致外，更较为系统完整的重现该信号通路的作用情况，使实验结果更具备说服力。由此，通过沉默ANXA2基因可能对结肠癌的预后改善及后续基因靶向治疗带来新的思路和策略。

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Effects of Annexin A2 on the Invasion and Migration of Human Colon Cancer Cell Line SW620*

Jiang Li1, Zhang Guiying2, Zhang Xiaomei2, et al

(1.GastroenterologyDepartmentoftheFouthHospital,Changsha410006,Hunan,China; 2.GastroenterologyDepartmentofXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410006,Hunan,China)

Objective: To investigate the effects of Annexin A2 (ANXA2) on cell invasion and migration of human colon cancer cell line SW620. Methods: The expression of ANXA2 in SW620 cells was silenced by siRNA technique. The experiment was divided into three groups: interference group, control group and wild group. The levels of mRNA of ANXA2 in each group were detected by RT-PCR. The expressions of ANXA2, plasmin(PL), matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in each group were detected by Western blot method. The invasion and migration ability of SW620 cells in each group were detected by Transwell invasion assay. Results: Compared with the control group and the wild group, the level of ANXA2 mRNA, the expressions of ANXA2, PL, MMP-1, VEGF proteins and the numbers of SW620 transmembrane cells in the interference group were statistically significant higher or lower (P<0.05). And there were no significance in the above indicators between the control group and the wild group. The correlations between the expression of ANXA2 protein and the expressions of PL, MMP-1, and VEGF proteins and the numbers of transmembrane cells were positively correlated (P<0.05). Conclusion: Silencing of ANXA2 gene may play a role in the anti-tumor effect by down-regulating the expressions of PL, MMP-1 and VEGF proteins and inhibiting the invasion and migration of SW620 cells.

Annexin A2; Colon cancer; Plasmin; Matrix metalloproteinase-1; Vascular endothelial growth factor

2016- 07- 11

2016- 09- 08

*湖南省科技厅资助项目(编号2011FJ3012)

蒋丽, 女，(1979-)，湖南长沙人，副主任医师, 从事消化道肿瘤的基础研究与临床工作。

R735.3

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.05.002