不同月龄高原型藏绵羊睾丸组织中蛋白基因产物9.5和神经肽Y的分布比较

袁莉刚，曲亚玲，鲁玉荣，李　聪

( 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 )



不同月龄高原型藏绵羊睾丸组织中蛋白基因产物9.5和神经肽Y的分布比较

袁莉刚*，曲亚玲，鲁玉荣，李聪

( 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 )

摘要：旨在比较蛋白基因产物9.5(PGP9.5) 和神经肽Y(NPY) 在不同发育时期藏绵羊睾丸的组织分布特征，探索其对藏绵羊睾丸发育及生殖机能调节的相关作用。 采用睾丸摘除手术收集0.5、2、5、8、12及18月龄藏绵羊睾丸，应用免疫组织化学SP法及IPP图像分析技术研究PGP9.5和NPY的分布特征。PGP9.5和NPY在0.5月龄藏绵羊睾丸组织表达量较低，生殖母细胞中基本无表达，但2月龄时，PGP9.5表达量增加极显著(P<0.01)，且同年龄段PGP9.5表达量均极显著高于NPY(P<0.01)，至18月龄时，PGP9.5和NPY表达量明显升高，且与0.5月龄相比差异极显著(P<0.01)，二者在12月龄及以后初级精母细胞中表达均为阴性。PGP9.5在Sertoli细胞阳性信号随睾丸发育随年龄增加逐渐降低，至18月龄时基本无表达，其在各年龄段Leydig细胞及其周围血管壁呈阳性表达。NPY在Leydig细胞的阳性信号较弱，2月龄及以后各发育阶段睾丸Sertoli细胞中均为阳性表达，在血管壁的表达亦随年龄增加而增强。高原缺氧环境中，不同月龄高原型藏绵羊睾丸组织中PGP9.5和NPY的表达差异与Sertoli细胞发育及精子发生调控关系密切；PGP9.5在Leydig细胞强阳性，表明其与激素合成分泌相关，NPY表达随着月龄而增强，有利于加强睾丸血管舒缩以适应对低氧的调节，或在局部血液循环与Sertoli细胞之间物质传递发挥作用。

关键词：蛋白基因产物9.5；神经肽Y；藏绵羊；睾丸；免疫组织化学；年龄

睾丸神经分布特征在不同动物或人随年龄不同具有明显差异，对睾丸发育及功能具有重要调控作用。蛋白基因产物9.5(Protein gene product 9.5，PGP9.5)和神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)是参与调控下丘脑-促性腺激素释放激素的脉冲式释放和垂体促性腺激素释放的两种重要的神经肽，在人和多种哺乳动物的睾丸组织内均有显著分布，影响睾丸雄性激素生成和精子发生[1-3]。龚永光等[2]应用免疫组织化学分析表明，青年人睾丸神经活动主要由肽能神经调控；K.H.Wrobel等[4]发现，3～5周龄小猪睾丸分布有丰富的以NPY为主的肽能神经，在7～10周龄时神经支配显示不同程度降低，而成年公猪睾丸内则相对缺乏。目前国内外关于雄性生殖机能的研究广泛而深入，但是对于高原环境中哺乳动物睾丸神经调控的报道较少。研究表明，PGP9.5及NPY在青年牦牛睾丸组织显著分布，且NPY在老龄牦牛睾丸血管分布显著降低，二者在牦牛睾丸的分布与年龄有明显关系[5]。同一种属的动物随生长环境不同，神经肽的分布具有一定差异，NPY在平原黄牛及高原黄牛主要分布均在睾丸各级动脉血管周围或血管壁内，PGP9.5在高原黄牛Sertoli 细胞的分布明显较平原黄牛弱[6-7]；可见高海拔对牦牛等高原动物睾丸神经肽分布的影响不容忽视。藏绵羊是中国3大原始绵羊品种之一，能够很好的适应高原低氧环境。本组前期研究表明，成年藏绵羊睾丸精索及实质血管形成特殊的微形态结构，有利于维持其高原适应性生殖机能[8-9]，这些对于研究藏绵羊睾丸神经分布提供了基础。为此，本研究采用免疫组织化学方法和图像分析技术对PGP9.5和NPY在不同发育时期藏绵羊睾丸的分布特点进行比较分析，为进一步研究其睾丸神经分布及适应性调节提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物采集自甘肃天祝藏族自治县祁连乡养殖户，在同一群藏绵羊分不同组，从产羔后不同月龄分别经睾丸摘除手术收集样本，0.5月龄藏绵羊睾丸4对，2、5月龄睾丸各6对，8、12及18月龄藏绵羊睾丸各7对。1.1.2主要药品试剂NPY兔抗鼠多克隆抗体(bs-0071R)、PGP9.5兔抗鼠多克隆抗体(bs-3806R)、免疫组化染色试剂盒(SP-0023，美国ZYMED公司)，DAB显色试剂盒(c-0010)(北京博奥森生物技术有限公司)，APES防脱玻片(ZLI-9502，北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1样品固定和切片制备迅速将睾丸从阴囊中取出，睾丸实质组织切块，多聚甲醛固定20 h，流水冲洗24 h，常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、制备切片。

1.2.2免疫组化染色免疫组化SP法染色，免疫组化染色时，一抗分别为NPY-IgG和PGP9.5-IgG (稀释度1∶400)。阴性对照用0.01 mol·L-1的PBS，代替一抗(NPY和PGP9.5)进行染色。

1.3统计分析

2结果

2.1PGP9.5在藏绵羊睾丸组织中的分布

光镜下，0.5月龄藏绵羊睾丸生精上皮主要由Sertoli 细胞构成，生殖母细胞偶见，无明显管腔。PGP9.5在Sertoli 细胞为中等阳性表达，生殖母细胞为阴性表达；间质血管稀少，Leydig细胞阳性表达(图1a)。PGP9.5在2、5月龄藏绵羊睾丸管腔内生殖母细胞数量有所增加，免疫组织化学表达明显增强，分布位置与0.5月龄时基本相同，Sertoli 细胞及Leydig 细胞均为阳性表达，但是PGP9.5在生殖母细胞为中等强度阳性表达(图1b～f)。8月龄睾丸生精上皮不同程度发育，个别管腔生精上皮为1～2层，部分上皮已经发育为3～4层，管腔部分出现。生精上皮Sertoli 及生精细胞PGP9.5阳性信号明显，生精小管管周Leydig 细胞数量明显增加，观察到丰富的PGP9.5阳性信号分布(图1g，h)；间质血管壁及淋巴管内PGP9.5亦有中等阳性表达(图1h)。12月龄时生精小管横切面管腔明显，生精上皮为4～6层，发育程度不一致，个别管腔有明显成熟精子，PGP9.5在生精小管固有膜肌样细胞，除初级精母细胞外的各级生精细胞及Leydig 细胞为阳性表达，Sertoli 细胞弱阳性表达，间质血管为阳性表达(图1i，j)。18月龄以后，生精上皮发育成熟，基本为4～7层，腔面有大量成熟精子。初级精母细胞及Sertoli 细胞基本无表达，但Leydig 细胞及间质血管为阳性表达(图1k，l)。

2.2NPY在藏绵羊睾丸组织中的分布

NPY在0.5月龄藏绵羊睾丸生精上皮基本无表达，Leydig细胞均为弱阳性表达，血管壁无表达(图2a)；2、5月龄时，NPY在藏绵羊睾丸管腔内Sertoli 细胞及生殖母细胞均为阳性表达(图2b，c，d)，在Leydig细胞和毛细血管为阳性表达而在小动脉管壁无表达(图2e，f)。8月龄时在藏绵羊睾丸组织中分布有丰富的NPY阳性信号，绝大多数NPY阳性细胞定位在生精小管周围(图2g，h)。管周肌样细胞为弱阳性表达(图2h)，生精上皮各级生精细胞及Sertoli 细胞均为中等阳性(图2g，h)。12月龄藏绵羊睾丸Leydig细胞中NPY为弱阳性表达；初级精母细胞及各级血管和生精小管周围的肌样细胞表达均为阴性(图2i，j)。18月龄时NPY在生精小管内Sertoli 细胞、精原细胞、次级精母细胞和精子细胞为强阳性表达，在Leydig细胞表达较弱而在间质小血管为强阳性(图2k，l)。

各年龄组睾丸组织阴性对照无表达(图3)。

2.3PGP9.5和NPY在藏绵羊睾丸的免疫组织化学检测结果对比分析

免疫组织化学图像分析结果显示，PGP9.5和NPY在0.5月龄藏绵羊睾丸组织表达量较低，与之相比较，其余各年龄段藏绵羊睾丸组织中PGP9.5和NPY的分布有一定统计学差异；PGP9.5自2～12月龄后各组间统计学差异不明显，但是均显著高于同年龄段NPY的表达量；各年龄组NPY表达的平均吸光度在性成熟之前不具有统计学显著差异，性成熟后藏绵羊睾丸组织NPY表达量显著增加；PGP9.5和NPY在18月龄藏绵羊睾丸组织的表达不存在统计学差异(图4)。

3讨论

哺乳动物睾丸受丰富的神经支配，在性成熟前后神经内分泌与局部因子相互之间存在很多潜在的调节机制。研究表明，哺乳动物睾丸神经中大约一半是具有Y—免疫反应的神经肽[4]。K.H.Wrobel等[3]对不同年龄牛睾丸免疫组织化学研究表明，从犊牛～成年公牛，睾丸自主神经分布以肽能神经为主，随着年龄增加，PGP9.5和NPY阳性神经分布的差别会越来越小；研究报道，NPY及PGP9.5在35日龄之前大鼠睾丸分布较少，随着年龄增加睾丸逐渐发育分布也增多，发挥主要的调控作用[10]。青藏高原盛草期短，高寒缺氧、昼夜温差大，制约羔羊生长速度，高原型藏绵羊1岁左右性成熟，1岁半～2岁开始配种。本研究中PGP9.5和NPY在0.5月龄藏绵羊睾丸组织表达量较低，二者之间无明显差异，但2月龄时，PGP9.5表达量显著增加，且同年龄段PGP9.5表达量均显著高于NPY，提示在藏绵羊性成熟前参与睾丸调节的肽能神经以PGP9.5发挥主要的调控作用；18月龄时，PGP9.5和NPY表达量明显升高，且与0.5月龄相比差异显著，这与二者在人及牦牛的免疫组织化学分布特点相一致，表明随着睾丸发育至性成熟期前后，肽能神经的调控作用大大增强[2，5]。研究表明，NPY在青春期前后的大鼠前列腺副神经节的免疫组织化学反应阳性表达差异显著，且具有与雄激素水平增加相依赖的特性[11]；而在硬骨鱼类，NPY作为促生长激素和促卵泡激素释放调节因子，与性激素水平及性别分化密切相关[12]。本研究中藏绵羊睾丸组织NPY表达量在18与12月龄相比增加极显著，其与有机体生长性成熟发育及性激素水平增加的相关性有待于进一步分析。

睾丸肽能神经对雄性动物性腺功能发挥重要调控作用。研究表明，PGP9.5和NPY在幼龄牦牛睾丸生殖母细胞均为阳性表达，青年牦牛睾丸初级精母细胞为阴性，二者在幼龄及青年牦牛睾丸生精细胞的分化过程中发挥一定作用[5]。近年来，在睾丸精原干细胞体外培养研究中，通过免疫组织化学法检测PGP9.5或NPY在动物或人睾丸组织的分布，可将其作为识别生精细胞及其分化状态的分子标记；1月龄山羊生殖母细胞对PGP9.5为阳性反应，而在随后进一步发育中的生殖母细胞则为阴性；因此体外研究中利用这一特性培养1月龄山羊睾丸细胞进而有效分离A型精原干细胞[13-14]；W.Y.Lee等免疫组织化学研究表明，PGP9.5在2、3月龄犬的生精母细胞表达为阳性，并由此在体外通过筛选PGP9.5阳性克隆来培养生精细胞[15]。研究发现PGP9.5在性成熟前仔猪生殖母细胞及青春期猪睾丸精原细胞的表达逐渐降低，用于表达PGP9.5的胚胎干细胞转录因子1基因可作为青春期前筛选精原细胞的潜在标志物[16]。本研究中0.5月龄时，PGP9.5和NPY在藏绵羊睾丸生殖母细胞中基本无表达，之后在各年龄段生精细胞中的表达逐渐增强，而二者在12月龄初级精母细胞中表达均为阴性。因此，PGP9.5和NPY在性成熟前后藏绵羊生精细胞的表达差异，可为进一步研究PGP9.5或NPY作为分子标记进行生精细胞分离培养研究提供参考。

睾丸Sertoli细胞是决定精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)分化命运的关键细胞，动物性成熟前后，Sertoli细胞不同信号通路的激活控制着SSC增殖和分化因子的表达[17]。性成熟前Sertoli细胞处于不断发育变化过程中，不同发育时期其分泌细胞因子也不同。早期研究认为PGP9.5是检测睾丸Sertoli 细胞活性的神经标记，在蛋白降解变化时发挥重要作用，后来研究发现PGP9.5在大鼠睾丸组织的特异表达与其早期发育过程中异常的精子发生及缺陷修复密切相关[18-19]；免疫组织化学研究表明，PGP9.5在2岁龄双峰驼睾丸及隐睾Sertoli 细胞中有表达[20]；小鼠睾丸8和16日龄时仅阳性表达于精原细胞，而在30日龄及以后不仅在精原细胞表达，在Sertoli细胞也有表达[18]。本研究中PGP9.5在Sertoli阳性信号随藏绵羊睾丸发育表达强度逐渐降低，至18月龄时基本无表达，这与W.Y.Lee等在猪睾丸组织研究相一致，从5日龄～青春期前PGP9.5表达逐渐降低，性成熟后无表达[16]。因此，18月龄前后PGP9.5在藏绵羊睾丸Sertoli细胞的分布差异可能与Sertoli细胞发育及精子发生调控关系密切。M.Kanzaki等[21]研究报道，NPY基因在Sertoli细胞表达可诱导促性腺激素或细胞因子在睾丸内的作用，同时Sertoli细胞分泌因子影响NPY基因的表达。因此，NPY在Sertoli的高表达提示其可能与Sertoli细胞分泌功能密切相关。研究表明，缺氧对雄性生育能力的抑制不可忽视，睾丸局部血液循环中氧含量较低，可导致各种酶及蛋白降解能力降低，精子生成数量减少[22]；本研究中，NPY在2月龄及以后各发育阶段藏绵羊Sertoli细胞中均为阳性表达，且血管壁内由弱阳性表达逐渐随年龄增加而增强，在血管周围为高密度阳性信号分布，这与NPY在犊牛期及青年期牦牛睾丸分布特点相一致，在高原缺氧环境中，NPY表达随着月龄增加而增强，有可能加强睾丸血管舒缩的调节以适应对低氧的适应[5]，也可能在高原型藏绵羊睾丸局部血液循环与Sertoli细胞之间的物质传递发挥一定作用。

Leydig细胞是睾丸组织中分泌睾酮的重要体细胞，主要受下丘脑-垂体调控，多种神经肽对Leydig细胞类固醇激素的合成进行调节，Leydig细胞的凋亡使得血清睾酮水平显著下降，精子发生的内分泌调节机制出现紊乱，导致生精上皮萎缩，生精功能受损[23]。本研究中PGP9.5在各年龄段Leydig细胞及其周围血管壁呈阳性表达，提示其与激素合成分泌存在密切关系。研究表明，大鼠睾丸局部NPY 水平升高能够抑制睾丸酮的分泌，免疫组织化学检测其主要在血管壁高表达，认为NPY是通过局部微循环调节Leydig细胞分泌活动，提示NPY诱导的睾丸酮释放减少，可能通过NPY对Leydig细胞的直接作用[24]。本研究中随着睾丸发育，NPY在Leydig细胞的阳性信号较弱，而在血管壁的表达逐渐增强；另有研究表明，人睾丸组织NPY在Leydig细胞及血管壁强表达[25]，而本研究中也观察到幼龄及青年期牦牛睾丸Leydig细胞中有丰富的PGP9.5和NPY阳性表达，二者在血管壁则为强表达[5]，研究表明，PGP9.5及NPY在单峰驼睾丸纵隔及Leydig细胞的免疫组织化学分布表现出明显的季节性变化[26]，牦牛为典型的季节性发情的动物，其睾丸局部调节因子具有季节性变化的特点[27]。本研究中高原型藏绵羊的繁育也严格受高原环境的影响，因此，NPY及PGP9.5在其睾丸组织的表达是否也受发情季节的影响有待于进一步分析。

综上表明，高原缺氧环境中，不同月龄高原型藏绵羊睾丸组织中PGP9.5和NPY的表达差异与Sertoli细胞发育及精子发生调控关系密切；PGP9.5在Leydig细胞强阳性提示其与激素合成分泌相关，NPY表达随着月龄而增强，有利于加强睾丸血管舒缩以适应对低氧的调节，或在局部血液循环与Sertoli细胞之间物质传递发挥作用，NPY在Leydig细胞的作用可能与发情季节有关，本研究可为深入探索不同发育时期高原动物生精机能的神经调节提供参考。

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(编辑程金华)

Distribution of Protein Gene Product 9.5 and Neuropeptide Y in Tibetan Plateau Sheep Testis at Different Ages

YUAN Li-gang*，QU Ya-ling，LU Yu-rong，LI Cong

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Key words:PGP9.5；NPY；Tibetan Plateau sheep；testis；immunohistochemistry；age

Abstract:This experiment was conducted to investigate the distribution of gene product 9.5 (PGP 9.5) and neuropeptide Y (NPY) in Tibetan Plateau sheep testis and in an attempt to explore their relationships with testicular spermatogenesis at different ages.Testis from 0.5-，2-，5-，8-，12-and 18-month-old Tibetan Plateau sheep were sectioned and immunostained with antisera to the NPY and PGP 9.5.Furthermore，IPP (Image-Pro Plus) statistics methods were used to compare the average absorbance of PGP9.5 and NPY expression in all of these testis.The testicular parenchyma did not show any NPY- and PGP9.5-containing immunoreactivity in 0.5-month-old sheep，and very scattered immunoreactivities were present within the gonocytes，but the expression of PGP9.5 in testis of 2-month-old sheep was significantly stronger than NPY at the same age (P<0.01)，both of the PGP9.5 and NPY were strongly present in 18-month-old sheep(P<0.01).By contrast，no expression of NPY and PGP9.5 immunoreactivities were observed within the primary spermatocytes in 18-month-old sheep.The expression of PGP9.5 in Sertoli cells underlie age-related declines，which was poorly investigated at 12-month-old and no expression at 18-month-old，but they were obviously detected in Leydig cells and vscellum at different ages.The NPY expression in Leydig cells were also poorly investigated，and were mainly expressed in Sertoli cells in 2-month-old sheep testis，and after that，the expression of NPY in vscellum with a manner of age-related enhances.The results suggest that the PGP9.5 and NPY expression was significantly difference in Tibetan Plateau sheep testis at different ages might serve as regulators for the testicular functions，also the expression of PGP9.5 in Leydig cells in the testis reflect the functional regulates of testosterone.Namely，the distribution of NPY in the wall of testis vascular significantly stronger in a manner of age-related increase may provide new indexes for the research of plateau adaptability mechanism in testicular blood regulation，and play a role in the local microcirculation and the interactions with the Sertoli cells.

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.01.010

收稿日期：2015-06-10

基金项目：甘肃省财政厅基本科研业务项目(2012)；国家自然科学基金项目(31160488)；甘肃省自然科学研究基金(145RJZA223)

作者简介：袁莉刚(1974-)，女，甘肃陇南人，博士，教授，主要从事动物发育生物学研究 *通信作者：袁莉刚，E-mail：yuan2918@126.com，Tel：0931-7631229

中图分类号：S826.2

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)01-0071-08