PRF的制备及保存方法的研究进展

毛俊丽综述，王　拓，孙勇审校，陈红亮，赵　峰



综述.讲座

PRF的制备及保存方法的研究进展

毛俊丽综述，王拓，孙勇审校，陈红亮，赵峰

富血小板纤维蛋白；制备；方法；保存

富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）由法国科学家Choukroun等于2001年首次提出，与第一代富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）相比，第二代富血小板制品因其简化的制备和血液未经生化处理而得到广泛应用。骨增量术中，将PRF与骨移植材料混合，可以提高移植材料的稳定性及骨诱导性，从而起到止血、促进创口愈合、加速骨再生及骨改建等作用；也可以制备成膜，便于临床使用[1]。临床试验表明，富含生长因子的PRF混合骨移植材料应用于引导骨再生，可以提高成骨活性[1]。但PRF制作方法研究报道较多、较杂，保存方法尚无统一定论，本文就PRF的制作及保存方法做一综述。

1　PRF的制备

1.1制备原理制备PRF要求收集血液至不添加抗凝剂的试管，快速离心。由于缺乏抗凝剂，血液接触试管表面即开始凝结，因此为了成功制备PRF，快速血液收集和在凝血反应开始前直接离心是绝对必要的[1]。PRF制备过程同时进行着离心反应和凝集反应。离心作用即在离心机强大的离心力作用下，使血液中血细胞的沉降加快,把血液中不同沉降速率(基于粒子的大小、形状和密度等决定）的物质分开,实现血液分层[2]；凝集反应类似于人体生理凝血过程，依赖血液样本含有的少量凝血酶将纤维蛋白原缓慢转化为纤维蛋白网状结构，这种缓慢聚合过程更符合生理凝血机制，应用于临床也会引起一个更高效的细胞迁移和扩散,促进软硬组织愈合[3]。制备的PRF包括以下3层：上层贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，中间层PRF凝胶，下层为红细胞层[4]。

1.2离心方法PRF制备的关键是选择离心方法，离心方法主要由相对离心力（relative centrifugal force，RCF）和离心时间决定。而相对离心力越大，离心时间越久，血液中细胞破坏可能性越大[5]。RCF被广泛用来描述离心，它与转速和离心半径相关。RCF=1.118×10-6×R×W2(R为离心半径，单位为cm；W为每分钟转速，单位为r/min）[6]。

最常用PRF的制取方法是Choukroun等[7]在2001年提出的，采集10 ml全血到不含抗凝剂的试管内，立即采用3000 r/min(相对离心力大约400×g)，离心10 min。 Shahram等[8]采用的标准PRF制备方法是：采集9m l全血到不含抗凝剂的无菌玻璃涂层的塑料管，以2700 r/min离心12min；改良型富血小板纤维蛋白（advance platelet-rich fibrin，APRF）的制备方法是：采集10ml全血到不含抗凝剂的无菌纯玻璃管，以1500 r/min离心14min。PRF和APRF由于离心力的不同，特定的细胞类型构成不同。APRF应用于引导骨再生有可能成为一种理想的自体细胞供体，特别是中性粒细胞和巨噬细胞，各种细胞相互协作，促进伤口愈合和组织修复再生。程亚楠[2]分别采用2500 r/min（978×g)、3000 r/min（1408×g)、4000 r/min(2504×g)，离心10min，3种离心条件产物的纤维蛋白结构及细胞分布无明显差异。前两组的PRF中白细胞和血小板回收率及部分生长因子的释放量虽高于第3组，但差异无统计学意义。李艳秋等[9]分别采用2500、3000、3000 r/min离心10 min和3000 r/min分别离心10、15、20min的6种方式制备PRF，测定每种产物在7 d内TGF-β和PDGF-AB释放含量，结果3000 r/min离心10min释放量明显高于其他组。

1.3离心试管Mustafa等[10]用钛试管3500 r/min离心15 min制备T-PRF(titanium-prepared，platelet-rich fibrin)。T-PRF的血小板聚集过程和玻璃管制备的PRF相似，因其不含二氧化硅，具有更好的生物相容性。作为一种新的富血小板制品，经过初步动物体内实验，证实其在前15 d对于结缔组织形成方面具有极强的诱导再生潜力。李龙等[11]采集家兔血液，分别用塑料管和玻璃管制备PRF膜片，对比观察7个时间点VEGF的浓度变化，结果用塑料管制备的PRF比用玻璃管制备的释放VEGF含量低。

1.4除水方式血液经离心后，除水的方式有两种，一种方法是取出PRF凝胶静置10 min（缓慢脱水）；另一种方法是将PRF放入到PRF专用工具盒内，压制成膜或者块（快速脱水）。李艳秋[9]等将制备的PRF分别用缓慢脱水和快速脱水两种方式处理，结果发现其释放生长因子的含量无明显差异。生长因子及血小板镶嵌在纤维蛋白构成的三维网状结构中，挤压并不会丢失。因此，目前临床上常采用快速脱水的方式制备PRF。

2　保存方法

PRF作为一种源自自体的生物材料，临床上多采用新鲜制备的，其保存方法研究较少，并且尚未见有特别理想的保存方法。孙悦[12]将单纯利用冷冻干燥技术处理的PRF与新鲜PRF通过扫描电镜、降解性检测、对细胞增殖影响等方面进行对比观察，发现冻干后的PRF结构疏松多孔，其内的纤维网状已经消失，部分生长因子的释放及降解速度加快，但其生长因子的活性并无影响。将PRF放在聚碳酸1,2-丙二酯和聚琥珀酸丁二酯的共聚物膜上冻干得到的复合膜，其生长因子的释放及降解速度较新鲜PRF减缓，这种复合冻干膜还具有支架作用，有望成为PRF保存应用研究的新方向。为了研究PRF体外生长因子的释放曲线，李龙等[11]将制备的PRF置于无菌DMEM培养基中，分别放置于4℃和37℃下培养，分别在7个时间点收集析出液，保存于-20℃，测定其VEGF浓度值，得出结论4℃比37℃培养条件下释放VEGF含量高。

3　小结

PRF已广泛应用于口腔颌面外科、口腔种植修复与牙周病等，目前大部分学者采用的人体PRF制作方法是：采集人体血液置于标准PRF无菌玻璃涂层的塑料离心管内（不添加抗凝剂），用德国PROCESS PC-02离心机，在3000 r/min即刻离心10 min或2700 r/min即刻离心12 min；取出PRF凝胶放入PRF制备工具盒，压制成块或者膜。虽有报道新方法制备的血小板衍生物，如APRF、TPRF具有某些方面发展潜力，但其仍有待进一步动物实验及临床研究。由于PRF制作方法较为简单，其蕴含的生长因子在制作完成后1 h内大量释放，以及没有很好的保存方法[2]，故建议在制作后尽早使用。

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R 783.9

A

1004-0188（2016）03-0326-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.038

全军“十二五”科研面上课题（CWS11J024）

646000四川泸州，四川医科大学口腔医学院（毛俊丽，王拓）；成都军区机关医院口腔科(孙勇，陈红亮，赵峰)

孙勇,E-mail:2623457656@qq.com

（2015-12-23）