Lnc RNA FER1L4对神经胶质瘤细胞增殖侵袭和凋亡能力的影响

夏 亮 孙才兴 冯 方 吴 斌⋆

·基础研究·

Lnc RNA FER1L4对神经胶质瘤细胞增殖侵袭和凋亡能力的影响

夏 亮 孙才兴 冯 方 吴 斌⋆

目的 研究Lnc RNA在神经胶质瘤细胞中的表达，及其对胶质瘤细胞增殖，侵袭及凋亡能力的影响。方法 采用RT-PCR检测Lnc RNA FER1L4在不同胶质瘤细胞株S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44，LN-18和对照星形胶质细胞1800中的的表达，SiRNA技术沉默FER1L4表达后，采用CCK-8，Transwell侵袭实验，流式细胞技术检测胶质瘤细胞增值、侵袭、凋亡的变化。结果 Lnc RNA在胶质瘤细胞株中表达明显高于正常对照星形胶质细胞。SiRNA下调Lnc RNA表达后，发现神经胶质瘤细胞增殖与侵袭能力明显下降，凋亡细胞数明显增加。结论 Lnc RNA FER1L4可能在胶质瘤发生与发展过程中发挥了重要作用。

长链非编码RNA FER1L4 生物学功能

胶质瘤是最常见的原发性恶性神经系统肿瘤之一，尽管采取积极的手术治疗，但目前绝大部分患者预后仍较差，尤其是胶质母细胞瘤，其平均生存期≤2年［1］。研究证实，神经胶质瘤的发生和发展与各种癌基因或抑癌基因异常表达密切相关［2］。长链非编码 RNA（LncRNA）是一类不编码蛋白质并且转录本长度＞200 个核苷酸的RNA。目前研究已证实LncRNA 与不同人类恶性肿瘤的发生发展密切相关，一些 LncRNA 在肿瘤与正常组织中存在差异表达，而这些差异表达的 LncRNA 可能参与了肿瘤的发生与发展过程［3］。FER1L4作为长链非编码RNA的重要成员之一，其与肿瘤发生与发展密切相关，近年来多个研究已证实FER1L4表达与结肠癌和胃癌发生密切相关［4］。本研究旨在探讨FER1L4与胶质瘤细胞增殖、凋亡与侵袭的关系，为神经胶质瘤的早期诊断和治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 神经胶质瘤细胞U251，U87-MG，SHG-44，S373-MG，LN-18，以及对照正常星形胶质细胞1800均购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶，DMEM细胞培养液、Trizol及Lipofectamine2000 转染试剂均为Invitrogen公司产品；细胞培养耗材为BD公司产品；FER1L4引物由上海Invitrogen公司设计合成；SiRNA干扰序列由Life技术公司提供，siRNA干扰序列正义链5'-UUAACUCGAAGCUGUCCUGTT-3'，反义链：5'-CAGGACAGCUUCGAGUUAATT-3'，对照组正义链：5'- ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'反义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。CCK-8细胞活性检测试剂盒购于日本同仁化学公司；Transwell小室购自Millipore公司，Matrigel由BD公司生产；AnnexinVFITC/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司；引物合成及测序在上海Invitrogen 公司完成。

1.2 方法 （1）细胞培养：神经胶质瘤及正常星形胶质细胞1800均培养于含10%胎牛血清，1%青链霉素的DMEM培养基，培养温度为37℃，5%CO2的培养基中培养。细胞融合度达80%时传代及进行相关操作。转染前24h，细胞接种于六孔板，约4×105个细胞/孔，加入含10%血清的培养基，放入培养箱中培养过夜，待细胞约70%～80%汇合度时进行转染。加入质粒4μg/孔和转染试剂10μl，同时转染空载体作为阴性对照，同时将培养基换成无血清培养基。转染6h后更换培养基。（2）PCR：Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计定量，按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，RT-PCR扩增。FER1L4引物正义链：5'CCGTGTTGAGGTGCTGTTC-3'；反义链：5'GGCAAGTCCACTGTCAGATG3'。内参GAPDH正义链：5'：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' 反义链：5'AATGAAGGGGTCATTGATGG-3'。PCR反应条件为95℃2min预变性，95℃30s，55.4℃30s，74℃30s，共35个循环，72℃10min延伸。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，发光成像系统拍照，以FER1L/GAPDH灰度值比值作为FER1L的相对表达量。（3）细胞转染：转染前1d，将细胞接种于六孔板，4×105个细胞/孔，加入2ml含10%血清的培养基，放入培养箱中培养过夜，待细胞汇合度在70%～80%时进行转染。加入质粒4μg/孔和转染试剂10μl，同时转染空载体作为阴性对照，同时将培养基换成无血清培养基。转染6h后更换培养基。（4）CCK-8细胞增值实验：取对数生长期细胞，约5000个细胞份额分别接种于96孔板中培养，并设3个复孔。转染24h、48h、72h、96h后分别加入CCK-8溶液10μl/孔，再次放入培养箱中培养2h，酶联免疫检测仪于450nm处测定每孔吸光值，比较各组细胞的生长情况。（5）Transwell侵袭实验：在Transwell小室中铺Matrigal goal，放入培养箱，待基底膜干燥后，滴入单细胞悬液培养24h，显微镜下观察各组穿透基底膜的细胞数量，随机计数5个视野，取平均值。（6）Annexin V/PI凋亡实验：当各组细胞融合度达80%左右时，洗净培养基，0.25%胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，PBS洗涤细胞3次，悬浮细胞。悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC，缓慢混匀后孵育15min。加入10μl PI后缓慢混匀于（2～8）℃避光条件下孵育5min。在30mins内流式细胞仪检测。判定标准：左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；左上象限是晚期凋亡细胞，为（FITC+/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验；P＜0.05为差异有统计 学意义。

2 结果

2.1 体外证实长链非编码RNA FER1L4高表 达于胶质瘤细胞 PCR检测不同胶质瘤细胞S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44，LN-18，以及对照星形胶质细胞1800中FER1L4的表达情况，分别为（1.563±0.250），（1.887±0.285），（1.260±0.178），（1.358±0.301），（0.583±0.210），（0.263±0.080）。结果显示FER1L4在所有胶质瘤细胞中表达均高于对照正常星形胶质细胞，且其在胶质瘤 细胞S373-MG和U251表达最高。

2.2 SiRNA干扰LncRNA FER1L4的表达 为进一步研究LncRNA FER1L4在胶质瘤细胞 中的生物学功能，选取高表达FER1L4细胞株S373-MG和U251，通过SiRNA处理两株细胞48h后，S373-M G和U251细胞中FER1L4表达均明显下调［（1.919±0.185）vs（0.694±0.131），P=0.005；（1.583±0.1145）vs（0.630±0.104），P=0.004）］。

2.3 LncRNA FER1L4对胶质瘤细胞增值，凋亡和侵袭能力的影响 采用 SiRNA干扰FER1L4表达后，采用CCK-8、Transwell侵袭实验，流式细胞凋亡技术检测胶质瘤细胞增值侵袭 凋亡的变化。CCK-8实验检测细胞增殖的结果显示，S373-MG和U251细胞Si-FER1L4组（干扰组）细胞的存活率均明显低于Control组（对照组）（P=0.003，P=0.001）（见图1）。AnnexinV PITC/PI双染法检测细胞凋亡的结果显示，Si-FER 1L4组发生凋亡的细胞比例均高于Control组［S373-MG：（23.00±1.732）vs（10.220±1.283），P=0.004；U251：（29.00±1.732）vs（19.330±1.856），P=0.019）］。Transwell实验检测结果显示，Si-FER1L4组细胞每个视野的穿膜数量均低于Control组［S373-MG：（17.00±2.082）vs（62.67±2.963），P=0.0002；U251：（24.67±1.764）vs（72.33±2.603），P=0.0001］（见图2）。

图1 FER1L4下调表达对神经胶质瘤细胞U251（A）及U373-MG（B）增殖的影响

图2 FER1L4下调表达对神经胶质瘤细胞U251及U373-MG侵袭能力的影响

3 讨论

进一步研究和揭示神经胶质瘤的分子发病机制，寻找新的治疗途径和基因治疗靶点，一直以来是神经胶质瘤相关研究领域的热点［2］。LncRNA作为RNA 聚合酶Ⅱ转录的副产物，开始被认为是基因转录的“垃圾”，并不具备生物学功能。然而，近年的相关研究证实，LncRNA具有诸多生物学功能，包括参与染色质修饰、染色体沉默、转录调控等多种生物学过程；以多种形式影响蛋白功能；影响miRNA含量［4］。

目前研究证明，胶质瘤的发生发展与LncRNA异常表达 关系密切［5］。目前 在神经胶质瘤中相对研究较多的LncRNA有MEG3和H19等。MEG3作为第一个被发现的具有肿瘤抑制作用的LncRNA，相对于正常组织，其在对应的肿瘤组织中表达下调。在82%的胶质瘤中，MEG的表达呈现缺失或大幅下调，MEG3的表达下调进而调节p53的活性，有利于胶质瘤细胞在体外的生长。因此，MEG3 可能是胶质瘤发生、发展的调节因子，也可能成为胶质瘤治疗的新靶点［6］。H19 为最早发现的LncRNA之一，属于母源性印迹基因，其高表达于胚胎发育期的内胚层及中胚层来源的组织［4］。研究证实，H19 同时具有致瘤和肿瘤抑制的双重功能。Yan等对神经胶质瘤组织和细胞中H19的表达及生物学功能进行研究，发现H19 表达与脑胶质瘤的WHO分级及恶性程度密切有关，H19可通过下调下游靶基因miR-675及CDH13从而发挥促进胶质瘤细胞的生长与增殖的作用［4］。另有研究证实，H19还可调节星形胶质细胞 瘤形成的关键信号蛋白CLI1的表达活性，从而发挥相应的肿瘤生物学功能［4］。

FER1L4作为一种新发现 的长链非编码RNA，目前研究主要集中在胃癌和结肠癌。Liu等［7］的研究中，首先证实相对应癌旁组织，FER1L4在91.80%的胃癌组织中表达明显下调，且FER1L4的低表达与胃癌的肿瘤体积、恶性程度、淋巴及远处转移、浸润深度、TNM分期、血管神经浸润和血清CA72-4表达均明显相关，因此，结果证实FER1L4的表达高低可作为胃癌早期诊断的较为优良的重要指标。随后研究表明FER1L4能够作为一种重要的内源性竞争RNA，且在结肠癌中扮演了抑癌基因的作用，其表达与miR-106a-5p表达明显负相关，两者的表达 均与结肠癌肿瘤浸润深度、血管侵袭、淋巴结转移及临床分期密切相关［8］。通过外源性增加FER1L4的表达能够明显下调miR-106a-5p表达，从而影响结肠癌的增殖、迁移和侵袭。上述研究均证实，FER1L4在胃癌和结肠癌中可能扮演了抑癌基因的作用，且其表达高低可作为胃癌及结肠癌早期诊断和预后评价较为优良的指标。

本实验通过检测不同胶质瘤细胞及正常对照星形胶质细胞中FER1L4的表达，发现FER1L4在胶质瘤细胞中明显高于对照星形胶质细胞。同时，下调FER1L4可显著抑制胶质瘤肿瘤细胞的增殖和侵袭力，促进细胞凋亡，提示LncRNA FER1L4基因可能具有抑癌的功能，在神经胶质瘤的发生、发展中发挥作用，有望为神经胶质瘤的早期诊断和基因治疗提供更有效的作用靶点。然而，LncRNA FER1L4影响神经胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭能力的途径及具体分子机制仍然未知，需进一步的深入研究。

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Objective To determine the expression of LncRNA FER1L4 and evaluate its clinical value in glioma. Methods The expression of LncRNA FER1L4 in glioma cell lines S373-MG，U251，U87-MG，SHG-44 and normal astrocyte 1800 was determined by RT-PCR. SiRNA targeting FER1L4 was transfected into S373-MG and U251 glioma cell lines，and cell proliferation，invasion，and apoptosis were examined by CCK-8 assays，transwell chamber assays，and Annexin V/PI analysis，respectively. Results The expression of FER1L4 in glioma cell lines was obviously higher than that in the normal astrocyte. Furthermore，by down-regulating FER1L4 using siRNA，the invasiveness and proliferation of the astrocyte decreased considerably，while the apoptosis increased. Conclusions FER1L4 plays an important role in the occurrence and progression of glioma.

LncRNA FER1L4 Biological function

国家自然科学基金（812713681）；浙江省肿瘤医院青年科研基金（QN201402）

310022 浙江省肿瘤医院

*通信作者