细胞因子和应力对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

张淋坤 综述，赵志河 审校

（天津市口腔医院口腔正畸科，天津 300041）

细胞因子和应力对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

张淋坤 综述，赵志河 审校

（天津市口腔医院口腔正畸科，天津 300041）

细胞因子；力；骨髓间充质干细胞；成骨分化

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞。骨髓中间充质干细胞的数量最多，称为骨髓间充质干细胞（BMSCs）；其它来源于外胚层的组织或发育过程中含有外胚间充质的组织已证实含有间充质干细胞的有皮肤、脂肪、牙周膜等[1-2]。BMSCs属于成纤维样细胞，在不受任何刺激的情况下体外培养，细胞形态与成纤维细胞非常相似，不易区分，成纺锤形或长梭形。BMSCs在相应的培养环境中可以向成骨、软骨、神经、脂肪、心肌等多方向分化。随着在体外传代次数的增加，BMSCs的增殖能力、成骨和成脂分化的能力均有所降低，而成软骨能力却没有明显下降；其成骨、成软骨和成脂能力均可以保持到细胞衰老。多种诱导因素均可刺激BMSCs向成骨细胞分化，其中细胞因子和力学因素起着很重要的作用。

1 细胞因子

在BMSCs成骨分化的过程中，多种细胞因子发挥了重要作用。其中作用比较明确的有骨形成蛋白（BMPs），转化生长因子β（TGF-β），白细胞介素6及其受体（IL-6/IL-6R）等。

1.1 骨形成蛋白（BMPs）

骨形成蛋白属于转化生长因子超家族，是强的成骨诱导因子之一，可以启动BMSCs成骨分化过程。BMPs可能是诱导BMSCs向成骨方向分化的基本信号分子。其中诱导成骨作用最强的是BMP-2、4、7。BMPs在诱导BMSCs成骨分化的同时，可以抑制BMSCs向其他方向（比如成脂方向）分化，从而有利于骨的生长和再生。BMPs的合成与分泌受到较多因素的影响。将人BMP-2基因转染进入BMSCs，可以被BMSCs大量表达，显著提高BMSCs的成骨分化能力[3]。巨噬细胞可以通过分泌BMP-2来诱导BMSCs向成骨细胞分化，这在受伤的骨组织中尤为明显[4]。粒细胞集落刺激因子（GCSF）过表达时，会减少BMP-2的生成，从而抑制成骨细胞的产生[5]。磷酸二酯酶抑制剂，如己酮可可碱，则可能通过促进cAMP产生来增强BMP-4的诱导成骨功能[6]。BMP-2、4是BMSCs成骨分化信号转导的关键环节，Liu等[7]在研究不同材料对BMSCs成骨分化的影响时发现羟基磷灰石纳米支架材料可以显著上调BMSCs内BMP-2/4、Runx 2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和整合素的表达，并且在整合素—BMP/Smad信号通路的关键调节蛋白Smad1/5/8出现明显的核内定位以后，骨钙素的表达显著上调，从而证明整合素—BMP/Smad信号通路的激活可以明显促进BMSCs的成骨分化。组织工程领域的研究显示，BMPs可以吸附于支架材料上并可以实现缓释，Wang等[8]将BMP-2吸附于纳米仿生羟基磷灰石包被的京尼平-壳聚糖共轭支架材料，实现了连续14 d的缓释；在这14 d中，BMSCs成骨标志物碱性磷酸酶、Runx 2、骨钙素的上调持续了14 d，骨桥蛋白的上调持续了3 d，从而证明了BMP-2对BMSCs成骨分化具有明显的促进作用。

BMPs和其他细胞因子之间以及BMPs之间存在着复杂的协同作用机制。松弛肽对BMP-2诱导的BMSCs成骨分化有明显的协同促进作用。BMP-2通过与其受体Rxfp 1结合，激活BMSCs内的Smad、P38信号通路，上调Runx 2的表达和活性，从而促进BMSCs成骨分化。而松弛肽一方面可以通过与BMP-2的协同作用直接强化上述作用，另一方面可以直接上调BMP-2受体Rxfp 1的表达，从而与BMP-2发生协同作用，强化BMP-2对BMSCs成骨分化的诱导作用[9]。BMP-4和BMP-7联合应用促BMSCs成骨分化的作用明显强于单独应用BMP-4或BMP-7[10]，BMP-4可以上调血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达，而敲除BMP-6基因也可以上调VEGF的表达，BMP-2可以上调表皮细胞生长因子（bFGF）的表达，BMP-5可以上调SDF-1，这些因子与BMP之间存在相互作用，BMPs之间可以通过这些因子发挥协同作用[11]。

由于BMP-2具有显著的促进成骨分化的作用，可以将其作为治疗骨质疏松和骨缺损的潜在药物进行开发。为了观察BMPs对于骨质疏松的治疗作用，Li等[12]对6月龄雌性SD大鼠行双侧卵巢切除术（去势大鼠），术后3个月行X线检查证实去势大鼠已罹患骨质疏松；然后取其BMSCs进行培养，并在实验组培养基中加入重组人BMP-2（rhBMP-2）；2周后发现实验组钙结节明显多于对照组，碱性磷酸酶活性和血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达均明显高于对照组，从而证实BMP-2可以通过上调VEGF表达的机制促进去势大鼠的BMSCs成骨分化。治疗骨缺损方面，BMP-2可以诱导BMSCs归巢，并通过这种机制加速骨愈合和再生。Gohil SV等[13]制造了颅骨缺损的动物模型，然后在缺损部位局部应用rhBMP-2和（或）植入BMSCs，二者发现单独和联合应用都可以促进骨缺损的愈合，而且成骨现象并不仅仅局限于缺损部位，其周边正常骨组织也发生了显著的成骨现象。Zhang等[14]将含有BMP-2的丝绸支架材料植入裸鼠皮下，自尾静脉注入BMSCs，观察到BMSCs明显聚集于含有BMP-2的丝绸支架材料的植入部位，从而证实了BMP-2对BMSCs归巢的趋化作用；同一研究又将含有BMP-2的丝绸支架材料植入兔的骨缺损部位，从耳缘静脉注入BMSCs，观察到了更强的BMSCs归巢作用，Micro-CT和组织切片发现骨缺损处的骨质再生受到了明显的促进。

1.2 转化生长因子β（TGF-β）

关于TGF-β的成骨诱导效应有两方面的观点：Locklin等[15]认为TGF能够抑制BMSCs的增殖，能提高其ALP的表达，并能减少和延迟BMSCs成脂分化；而现在比较普遍的观点认为TGF-β主要通过促进细胞分裂增殖促进成骨细胞产生和Ⅰ型胶原合成、促进基质钙化等作用来增强骨损伤的修复能力。Zhao等[16]在鼠BMSCs的培养液中加入转化生长因子β1（TGF-β1），2周后发现BMSCs对成骨分化标志物Runx 2、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原的表达上调了7倍，碱性磷酸酶活性显著提高，而成脂分化标志物PPARγ的表达显著降低，从而证明TGF-β1的促成骨分化效应。TGF-β的促细胞分裂增殖作用使间充质细胞、软骨细胞和成骨细胞数量大量增加，这不仅为BMP诱导成骨提供了更多的靶细胞，也为骨组织再生修复提供了物质基础。TGF-β的作用有赖于转化生长因子β激酶（transforming growth factor-β activated kinase，TAK）的活性，松弛肽可以提高TAK的活性，从而与TGF-β发生协同作用，促进BMSCs成骨分化[9]。

1.3 白细胞介素6及其受体（IL-6/IL-6R）

关于IL-6/IL-6R诱导BMSCs成骨分化的研究，目前存在两种观点：Taguchi等[17]学者认为，BMSCs表达IL-6R，IL-6与之结合后，可以激活JAK/STAT信号转导通路，诱导未定型的BMSCs分化，使ALP活性增强，表现出成骨表型。然而，另有学者认为IL-6只是对骨源性成骨细胞或骨髓瘤细胞具有诱导成骨作用，对未定型的BMSCs诱导成骨作用并不明显[18]；而在地塞米松（Dex）等辅剂作用下已有明确成骨倾向的BMSCs中加入可溶性IL-6（sIL-6）或IL-6/sIL-6R时，BMSCs的成骨作用加强，这主要是通过BMSCs表达的Gp130来实现的[15]。然而Rauner和Guzmán-Morales两个课题组分别研究了地塞米松（DEX）在促进BMSCs成骨分化的同时，炎症因子的表达，发现在成骨分化的过程中，BMSCs对集落细胞刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β、4、6、10（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10）等炎症因子的表达都是被抑制的，与此同时Runx 2、碱性磷酸酶的表达明显上调，细胞外基质的矿化也显著加强。Rauner课题组还发现在DEX诱导的BMSCs成骨分化早期，BMSCs的增殖被提高了7%～10%，而凋亡被抑制了25%～30%[19-20]。

2 力学刺激

2.1 张应力对BMSCs分化的影响

张应力可以促进BMSCs向成骨方向分化已经成为学术界的共识。Jagodzinski等[21]对人BMSCs施以1 Hz、2%和8%的轴向张应力，发现8%的形变大小能够显著提高ALP、骨钙素（osteocalcin）、I型胶原和Runx 2的表达，而2%的形变大小与对照组相比没有明显变化。Simmons等[22]使用成骨诱导培养基培养人BMSCs，同时施加0.25 Hz、3%的周期性双轴拉伸，与未加载的对照组相比，周期拉伸刺激后细胞基质矿化提高2.3倍，而且BMSCs呈现出更加成熟的成骨细胞表型。Koike[23]通过Flexercell系统研究双轴张应力对干细胞系ST2成骨分化的影响，发现较低力值（0.8%～5%）下张应力能够更有效地促进成骨分化。Grottkau[24]比较了相同力值的机械张应力对BMSCs和脂肪干细胞 （ASCs）成骨分化的影响，发现ASCs在收到张应力作用后，细胞排列方向改变为垂直于张应力方向，而BMSCs的排列没有明显改变；称骨标志物Runx 2和Osterix的表达无论开始上调的时间还是表达量都没有明显差异，而骨钙素和BMP-2的表达量虽然没有差异，但是开始上调的时间BMSCs明显晚于ASCs，从而说明ASCs和BMSCs都可以在张应力的诱导下向成骨细胞方向分化，但ASCs较BMSCs对张应力的反映更加敏感。

2.2 压应力对BMSCs分化的影响

对成骨细胞的研究显示，压应力可以刺激人成骨细胞系高表达骨涎蛋白和骨形成蛋白（BMP）并且低表达它们的拮抗物，从而诱导成骨[25]。受到这项研究结果的启示，同一课题组又将压应力作用于干细胞，并研究其分化方向，发现压应力可以显著增强干细胞成骨 （Runx 2、Msx 2、Dlx 5、Osterix）和成软骨（Sox 5，9）标记物的表达水平，同时降低成肌（MyoD）和成脂（PPARγ）标记物的表达水平[26]。这说明，压应力可以诱导干细胞向成骨和成软骨方向分化；信号通路的研究显示，压应力促进成骨和成软骨是通过不同的信号通路进行的。压应力可以通过P38MAPK途径提高Runx 2的表达，从而促进干细胞向成骨方向分化[26]。同时，压应力还可以通过BMPs途径诱导干细胞向成软骨方向分化，Wang等[27]将周期性压应力加载到大鼠BMSCs观察期成软骨分化，发现周期性压应力不仅可以直接诱导BMSCs成软骨分化，同时可以促进BMSCs增殖，并提高其数量和活力，上调Ihh,Cyclin D 1,CDK 4,和Col2α1的表达；在此过程中MEK/ERK和P38 MAPK信号通路没有参与，而BMP信号通路却扮演者重要角色。

2.3 流体剪切力对BMSCs分化的影响

由于骨组织内存在大量的微管，外界的应力作用于骨组织产生的应变，必然引起这些微管内的液体的流动，这就会给成骨细胞带来流体切应力的影响。因此，流体切应力对成骨类细胞的影响就成了研究的热点。

对于成骨细胞的研究发现，流体切应力可以促进成骨细胞的分化成熟，抑制其凋亡；并诱导成骨细胞表达成骨相关基因和蛋白，而这种效应与流体切应力的大小，作用时间，细胞培养条件等因素有密切关系[28]。

BMSCs在流体切应力作用下的分化效应，不同的研究者有着不同的看法。Riddle等[29]认为不同大小的流体切应力可以通过MAPK途径和钙离子通道促进BMSCs的增殖，而Li等[30]却认为周期性流体切应力可以明显的使BMSCs向成骨方向分化，同时量效和时效研究发现2.0 Pa的流体切应力作用下3 min后，就可以观察到钙沉积的显著提高，而1.0 Pa的流体切应力作用2 h后，BMSCs的成骨相关基因也显著表达。分析这些研究结果存在差异的原因，可能和各研究者的研究目的不同，所选指标不同，施加的流体应力的大小、作用时间等不同所导致。

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（2015-11-12收稿）

R318

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.022

张淋坤（1975-），男，副主任医师，博士。E-mail:zlkxjtu@163.com