miR-30b在肾癌中的表达和临床意义

全晶　潘翔　金露　桂耀庭　杨尚琪　毛向明　来永庆

230032合肥，安徽医科大学(全晶、潘翔、金露)；北京大学深圳医院泌尿外科 北京大学深圳医院男性生殖实验室(桂耀庭、杨尚琪、毛向明、来永庆)



·实验研究·

miR-30b在肾癌中的表达和临床意义

全晶潘翔金露桂耀庭杨尚琪毛向明来永庆

230032合肥，安徽医科大学(全晶、潘翔、金露)；北京大学深圳医院泌尿外科 北京大学深圳医院男性生殖实验室(桂耀庭、杨尚琪、毛向明、来永庆)

【摘要】目的通过检测miR-30b在肾癌组织及其配对癌旁正常组织中的表达水平，探讨其与临床病理特征之间的相关性，为进一步研究在肾癌发生、发展过程中miR-30b的作用奠定基础。 方法从33例经手术切除的肾癌组织及其配对癌旁正常组织中分别提取各自的RNA，经逆转录得到cDNA，使用RT-qPCR检测两者miR-30b的表达水平，通过统计学软件进一步分析其表达量与患者临床病理特征的相关性。同时，通过检测miR-30b在不同肾癌细胞系的表达量，分析miR-30b在正常细胞系和肾癌细胞系的表达差异。 结果miR-30b在肾癌组织中的表达量明显高于配对的癌旁正常组织(P<0.001)，其中22例肾癌标本miR-30b呈现高表达。肾癌组织中miR-30b的表达水平与患者的年龄、性别、肾癌组织类型、TNM分期及UICC/AJCC临床分期均无显著相关性(P>0.05)。miR-30b在不同肾癌细胞系表达水平不同，但均高于正常组织细胞系(P<0.05)。结论肾癌组织中miR-30b的表达明显上调，提示其可能与肾癌的发生、发展相关。

【关键词】肾肿瘤；miRNA；miR-30b；肿瘤分期

肾癌亦称肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)，是发生在肾实质小管上皮系统上的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的3%左右[1]，是我国最常见的肾实质恶性肿瘤之一。肾癌的临床表现无特异性，手术是其主要的治疗方法。然而，约30%的患者在初诊时就已有远处转移，即使经过手术切除，仍有约30%局部切除的患者出现复发，5年生存率随着肾癌侵犯的组织范围逐渐降低[2]。尽管目前已经发现了许多生物标志物与肾癌有一定的相关性，但是临床上却还未应用相关肾癌标志物作为诊断指标、治疗靶点或预后评价。因此发现新的肾癌生物标志物，对于肾癌的诊断、治疗及预后具有重要作用。

微小RNA(miRNA, miR)是一类广泛存在于真核细胞中长度大小约为22个核苷酸的非编码单链RNA。它们可以通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslated regions, 3’-UTR)非特异性结合从而达到抑制靶基因mRNA的转录的目的[3]。研究表明，miRNA在多种肿瘤细胞的增殖分化、新陈代谢及凋亡中起着重要的作用[4]。miR-30b是miR-30家族中的成员之一，在癌症发生、发展过程中具有重要的调节作用。已有研究表明它在结直肠癌、肺癌及胃癌等恶性肿瘤中均呈现低表达[5-7]。然而，miR-30b在肾癌中的表达和功能尚不明确。为了探讨miR-30b在肾癌中的作用，本研究在前期测序的基础上，通过实验对肾癌和癌旁正常组织中miR-30b的表达量进行定时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证，为寻找新的肾癌早期诊断及判断预后的标志物提供客观依据。

材料与方法

一、研究标本及临床资料

本研究所用标本来自北京大学深圳医院提供的33例肾癌及其配对的癌旁正常组织标本(收集时间为2013年1月至2015年8月，所用标本均获得患者知情同意，并签署知情同意书，均得到了北京大学深圳医院医学伦理委员会的批准)。每例标本包括手术切除后经病理证实的肾癌组织及其配对癌旁正常组织(距离癌组织>5 cm)各一份，均有完整的临床病理特征资料(表1)。在本研究中肾癌及其配对癌旁正常组织分别来自21例男性和12例女性，年龄25～70岁，中位年龄50岁。临床分期采用2009年国际抗癌组织/美国癌症联合会(UICC/AJCC)临床分期标准，组织学类型分类采用WHO 2004年肾癌病理分类标准。

二、主要仪器和试剂

普通PCR仪(BIO-RAD，USA)、罗氏荧光定量PCR仪(Lightcycler 480，USA)、NanoDrop 2000c紫外分光光度计(Thermo Scientific，USA)、miScript RT Kit(Qiagen，Germany)、miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)、RNA提取试剂Trizol(Invitrogen，USA)、常规试剂、低温冰箱、离心机等，由北京大学深圳医院男性生殖与遗传中心实验室提供。

三、细胞系及细胞培养

人胚肾细胞系：HEK-293T(中国医学科学院培养物收藏中心)。人肾癌组织细胞系：786O、ACHN、769P(美国细胞培养中心，美国)。细胞接种于DMEM培养液(由1%谷氨酰胺、1%抗生素和10%胎牛血清组成)，在37℃、5% CO2的恒温箱环境下培养。

四、miRNA的前期测序及筛选

本研究前期通过测序(由深圳华大基因研究所的Illumina Hiseq 2000测序仪测序完成)筛选出在肾癌组织及其配对癌旁正常组织上有差异表达的miRNAs，选取两者之间有显著表达差异的miR-30b作为研究对象。

五、提取总RNA

在液氮下研磨组织标本，按照说明书的步骤使用Trizol试剂提取细胞系及研磨后标本中的总RNA，使用NanoDrop 2000c紫外分光光度计测定其浓度。

六、获得cDNA

根据miScript RT Kit说明书中的步骤，取1 μl总RNA加入20 μl反应体系，在普通PCR仪上进行逆转录。接着在37℃ 60 min、95℃ 5 min的反应条件下合成cDNA，最后将其稀释10倍，放置于-40℃的冰箱保存备用。

七、检测miR-30b的表达

根据miScript SYBR Green PCR Kit说明书中的步骤，以逆转录合成的cDNA作为模板，在罗氏荧光定量PCR仪上进行qPCR反应。反应体系：miR-30b上游引物1 μl，2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，cDNA 1 μl，10×miScript Univeral Primer 1 μl，RNasefree water 6 μl。miR-30b上游引物为TGTAAACATCCTACACTCAGCT，下游引物为Qiagen公司所提供的通用引物。将U6 snRNA作为内参基因，U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。在95℃条件下反应2 min，随后95℃条件下反应10 s，55℃条件下反应30 s，72℃条件下反应30 s，重复做40个循环。共重复3次实验。

八、数据处理及统计学分析

设U6为内参，进行标准化处理，使用ΔΔCT法分析RT-qPCR所得数据(ΔCT= CTmiR-30b-CTU6，ΔΔCT= CTRCC-CTNormal)。将得到的ΔΔCT值通过2-ΔΔCT表示为miR-30b的相对表达量，将对应的相对表达量进行对数转换后发现符合正态分布。肾癌组织中miR-30b相对于癌旁正常组织的表达量的倍数通过2-ΔΔCT计算。使用SPSS 23.0进行统计学分析，分别采用配对t检验和Fisher确切概率检验分析肾癌和癌旁正常组织中miR-30b的表达量及 miR-30b表达水平与患者的临床病理特征的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、肾癌组织及癌旁正常组织中miR-30b的表达量

miR-30b在肾癌组织中的表达量显著高于癌旁正常组织。癌组织与癌旁正常组织中miR-30b的表达量比值进行Log2(T/N)转换，得到图1。将得到的ΔΔCT值通过2-ΔΔCT表示为miR-30b的相对表达量，分别计算miR-30b在肾癌组织及癌旁正常组织上的相对表达量并作图(图2)，配对t检验分析发现P=0.020。肾癌组织中miR-30b相对于癌旁正常组织的表达量的倍数通过2-ΔΔCT计算，得出ΔΔCT最小值为-13.443 3，最大值为13.605 0。计算所得倍数的平均值±标准差为(6.881 0±0.726 5)。

二、肾癌中miR-30b的表达水平与患者临床病理特征之间的相关性

肾癌中miR-30b的表达量与其相应的临床病理特征之间无显著相关性。将miR-30b相对表达量的平均值作为区分点，将病例分为两组，其中低表达组11例，高表达组22例。为进一步证明，行Fisher确切概率检验分析，结果显示肾癌中miR-30b表达水平与患者的年龄、性别、肾癌组织类型、TNM分期及AJCC临床分期无显著相关性(P> 0.05 )，见表1。

三、不同肾癌细胞系中miR-30b的表达量

miR-30b在不同肾癌细胞系中的表达水平不同，但均高于正常组织细胞系。在人胚肾细胞系(HEK-293T)及3个肾癌细胞系(786O、ACHN及769P)中的相对表达量分别为(1.00±0.04)、(5.30±0.16)、(3.12±0.12)、(25.2±2.02)，见图3，提示miR-30b在不同的肾癌组织细胞系中的表达水平均高于正常组织细胞系，其中以肾癌组织细胞系769P的表达量最高(P<0.05)。

讨论

肾癌作为我国第二大泌尿系肿瘤，其发病机制仍不明确，早期诊断亦非常困难。尽管手术治疗是目前最佳的治疗方法，但因绝大部分肾癌发现较晚，使术后仍有约30%的患者可出现复发。此外，因肾癌对放化疗不敏感，临床上仍缺乏有效的术后辅助治疗[8]。越来越多的研究表明，miRNA通过发挥促进或者抑制癌基因表达的作用来调节肿瘤的发生、发展[9]。通过miRNA表达谱的筛选，我们已经发现了多个肾癌特异性miRNA，进一步研究表明miRNA的异常表达能够破坏癌基因和抑癌基因的平衡，最终导致肾癌的发生[10]。因此，研究miRNA与肾癌发生、发展的关系尤为重要。

MiR-30家族是通过6个位于1、6及8染色体上的基因编码而成，包括miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e等5个成员，它们之间的序列同源性非常高，见表2[11]。由于它们之间极高的保守性以及重叠的表达模式，提示miR-30家族在生物功能上或许发挥着关键作用。目前研究发现miR-30家族与上皮细胞间质转化、成骨细胞分化及肿瘤发生、发展等均有密切关系[12-13]。尽管miR-30家族的5个成员同源性极高，但在功能上却表现不同。Baraniskin等[14]研究发现miR-30a通过DTL(denticleless protein homolog)-TP53-CDKN1A途径可以影响结肠癌基因的表达，miR-30a的高表达可以抑制结肠癌的发生、发展。Zhang等[15]通过RT-qPCR、Western blot分析等方法发现在结肠癌发生、发展过程中，miR-30c可以通过靶向结合ADAM19，进而发挥抑制结肠癌基因表达的作用。然而Gaziel-Sovran等[16]在研究黑色素瘤时发现miR-30b/30d的高表达具有促进肿瘤发生、发展的侵袭能力。D'Aiuto等[17]在研究乳腺癌中的异常表达基因时发现，miR-30e呈现高表达。

目前研究逐渐发现miR-30b与肿瘤的关系越来越密切。Chen等[8]发现miR-30b在非小细胞肺癌中呈现低表达，进一步研究表明miR-30b可以通过与Cthrc 1的3’-UTR相结合，从而调控肺癌在人体组织中的侵袭与转移。Mahdavinezhad等[18]在研究膀胱癌时，发现miR-30b在64%的膀胱癌标本中呈现高表达。Tian等[6]亦在胃癌中发现miR-30b呈现低表达，高表达的miR-30b可以促进细胞凋亡，抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及转移。然而，目前有关miR-30b在肾癌中的表达及其与临床病理特征之间的关系尚无相关报道，因此本研究在发现miR-30b在肾癌中呈现高表达的基础上，进一步探究了其与临床病理特征之间的关系。

本研究结果证实miR-30b在肾癌组织中的表达水平较癌旁正常组织显著增高。进一步的研究证明，miR-30b在不同的肾癌组织细胞系中的表达水平不同，但均高于正常组织细胞系，其中在肾癌组织细胞系769P中的表达最为显著。以上结果提示miR-30b在肾癌发生、发展中起着促进作用。此外，我们未发现肾癌组织中miR-30b的异常表达与患者的年龄、性别、肾癌组织类型、TNM分期以及AJCC临床分期有显著相关性。由于本研究样本量较小，会产生偏倚，需要进一步扩大样本量验证。

综上所述，本研究采用RT-qPCR检测miR-30b在肾癌组织及癌旁正常组织中的表达水平，并在此基础上分析了其表达量与临床病理特征的相关性，研究发现miR-30b在肾癌组织中呈现高表达，这提示其可能是一种新的促癌基因，进一步研究其功能和机制，或许会揭示miR-30b在肾癌发生、发展过程中不同于其他癌症的作用和机制，在未来可能会有广阔的前景。

参考文献

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(本文编辑：熊钰芬)

The expression and clinical significance of miR-30b in renal cell carcinoma

QUANJing*,PANXiang,JINLu,GUIYao-ting,YANGShang-qi,MAOXiang-ming,LAIYong-qing.

*AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,ChinaCorrespondingauthor:LAIYong-qing,E-mail:yqlord@163.com

【Abstract】ObjectiveTo test the expression of miR-30b in renal cell carcinoma (RCC) and paired adjacent normal tissues, and explore its relationship with clinical pathological characteristics and lay the foundation for further research of the role of miR-30b in the occurrence and development of RCC.MethodsTotal RNA of 33 RCC tissue and paired normal adjacent tissue resected from nephrectomy was isolated and reverse transcription was performed to obtain the cDNA. The expression of miR-30b was detected by real time quantitative PCR (RT-qPCR). Statistic analysis was performed to explore the relationship between expression of miR-30b and clinico-pathologic characteristics. In addition, analyse the expression difference of miR-30b in normal cell line and renal cell carcinoma cell line by detecting the expression of miR-30b in different renal cell lines. ResultsThe expression of miR-30b in RCC tissues was significantly higher than paired adjacent normal tissues (P<0.001), and 22 (67%) cases of RCC tissues showed up-regulation of miR-30b. No relationships were found between the expression of miR-30b and patient’s age, gender, histology, TNM stage, Fuhrman stage and UICC/AJCC stage. ConclusionsThe expression of miR-30b in RCC was significantly increased, suggesting that it may be play role in the occurrence and development of RCC.

【Key words】Kidney neoplasms;miRNA;miR-30b;Neoplasm staging

基金项目：国家自然科学基金(81101922)；深圳市科技研发资金知识创新计划基础研究项目(JCYJ20130402114702124; JCYJ20150403091443329)；广东省重点医学专科经费

通信作者：来永庆，E-mail：yqlord@163.com

doi:10.3870/j.issn.1674-4624.2016.01.008

(收稿日期：2015-12-22)