miR-491-5p在原发免疫性血小板减少症患者中的表达及临床意义*

丁 磊，刘 鹏，叶 辛，邓安梅，任永亚，吴天勤，钱 琤

(1.苏州市吴中区中西医结合医院，江苏苏州 215200；2.第二军医大学长海医院，上海 200433；3.解放军100医院，江苏苏州 215007)

miRNA也称microRN A，是真核生物中广泛存在的一种长度为21～23nt的RNA分子，可以通过诱发mRNA降解或抑制蛋白翻译的方式负调控靶基因[1]。研究表明miRNA参与生物干细胞分化、信息传递、器官生长发育、肿瘤等多个过程，因此miRNA的异常表达通常会导致疾病的发生[2，3]。

免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)，旧称为特发性血小板减少性紫癜，是一种自身免疫介导的以血小板下降为特征的出血性疾病[4，5]。其发病原因尚不清楚，T细胞、B细胞、巨核细胞、抗原递呈细胞等在ITP的发病过程均发挥作用，有文献报道miRNA与ITP之间存在着一定的联系[6～8]，本实验研究通过实时定量PCR的方法检测患者外周血单个核细胞中miR-491-5p的表达水平，分析其与患者血小板计数之间的相关性，为后续研究提供新线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集解放军第100医院血液科2014年9月～2015年9月收治的ITP初发患者外周抗凝全血40例，均未接受过相关治疗，诊断符合国内标准[9]，其中男性22例，女性18例，年龄25～65岁。其中经治疗后完全缓解者22例，男性12例，女性10例，年龄26～51岁；同期健康体检者40例作为对照组，其中男性21例，女性19例，年龄23～67岁。每例标本大约2 ml，所有标本在2 h内处理完毕并保存在-80℃冰箱待检。此项研究通过医院伦理委员会的批准，受试者均已签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 反转录试剂盒和PCR试剂盒购自Takara公司；Trizo试剂(Invitrogen life technologies)、淋巴细胞分离液、100 ml/dl乙醇、氯仿、异丙醇均购自国药集团化学试剂有限公司；DEPC水，红细胞裂解液，双蒸水，200 μl EP管，2 ml EP管，纯水仪，Centrifuge 5417 R低温高速离心机；紫外分光光度计(ND-1000，Nanodrop Technologies)、梯度PCR仪(ABI)、PCR仪(ABI7500)均产自美国。

1.3 方法

1.3.1 ITP患者治疗方案和疗效标准：①糖皮质激素(40 mg/天×4天)。②泼尼松(30 mg/kg/天)。③ITP的紧急治疗、不耐受肾上腺糖皮质激素、妊娠等患者可加用丙种球蛋白(400 mg/kg/天×5天)。ITP诊断及疗效标准参照国内专家共识[9]。

1.3.2 初诊组ITP患者分组标准：将初诊组ITP患者按上述方案治疗后，血小板>100×109/L且病情稳定的患者归完全缓解组，共22例；血小板<100×109/L的患者或治疗有效但复发的患者归未完全缓解组，共18例。

1.3.3 外周血单个核细胞(PBMC)分离和总RNA提取：所有患者在治疗前用EDTA-K2抗凝管采集空腹静脉血2 ml，对照组同样用EDTA-K2抗凝管采集空腹静脉血2 ml。用淋巴细胞分离液从2 ml静脉血中分离PBMC，用Trizol法提取细胞的总RNA，用紫外分光光度计(ND-1000，Nanodrop Technologies)检测所提取RNA 的浓度和纯度。

1.3.4 cDNA的合成以及real-timePCR反应：miR-491-5P和U6的特异引物由上海赛百胜公司设计和合成，用反转录试剂盒进行反转录，用定量PCR试剂盒(Tkara公司)进行核酸扩增，反转录和PCR条件及实验过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 5进行统计分析，组间均值比较采用独立样本t检验(studentttests)，相关性分析采用Pearson相关。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ITP患者各组外周血单个核细胞miR-491-5P的表达 初诊组(5.07±1.70)与对照组(1.92±0.95)外周血单个核细胞miR-491-5P的表达相比上调，差异有统计学意义(t=9.36，P<0.01)；治疗后完全缓解组(2.32±1.07)与其初诊时(4.95±0.83)外周血单个核细胞miR-491-5P的表达相比下调，差异有统计学意义(t=8.94，P<0.01)。

2.2 相关性分析 40例ITP初发患者外周血单个核细胞miR-491-5P与血小板计数呈负相关(r=-0.769 7，P<0.01)。

3讨论miRNA是作为一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，人体中存在大量的miRNA，20%～30%的mRNA是miRNA的作用靶点，但目前对miRNA在免疫性疾病中发挥的功能还有待进一步深入研究，如miRNA与ITP的发病与发展情况。

miR-491-5p属于miR-491家族，位于9p21.3脆性位点，近年来国内外学者对其研究也逐渐增多。Gong等[10]研究表明miR-491-5p通过作用IGF2BP1来抑制非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭，与相应癌旁正常组织比较，miR-491-5p在非小细胞肺癌组织中的表达显著下调；Zhao等[11]研究表明miR-491-5p抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长，这些功能是通过作用于靶基因人端粒酶逆转录酶(hTERT)来发挥的。与相应的癌旁正常组织相比，miR-491-5p在宫颈癌组织中表达显著下调。Yuan等[12]研究表明：miR-491-5p通过对MMP-9基因3'-UTRrsl056629A→C多态位点的结合，导致MMP-9蛋白表达的增高，从而增加了中国人动脉粥样硬化性脑梗死发病风险。Sheinerman等[13]研究表明miR-491-5p可作为轻度认知障碍的生物标志物之一。Yu等[14]研究数据表明了miR-491的过表达能抑制CD8+和CD4+T细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制CD8+T细胞产生IFN-γ。

本实验通过实时定量PCR的方法检测ITP初发患者外周血单个核细胞中miR-491-5p的表达水平，与健康体检对照组相比，在ITP初发患者中显著上调(P<0.01)；并且miR-491-5p的表达水平与ITP初发患者外周血血小板计数呈现负相关。这些均提示miR-491-5p可能参与ITP的发病过程，并且与其严重程度相关。另外我们对ITP初发患者治疗后跟踪调查还发现，完全缓解组经治疗后miR-491-5p的表达水平显著低于其初诊时miR-491-5p的表达水平，而未完全缓解组miR-491-5p的表达水平则基本未改变，这也提示miR-491-5p参与了ITP免疫功能的恢复及病情缓解。miRNA-491-5p是如何参与ITP的发病机制，通过作用于哪个靶基因及作用的具体通路有待于我们进一步研究。

我们的研究显示miRNA-491-5p在ITP初发病人中表达增高，可作为ITP早期的诊断标志物，并为后期ITP的诊断、治疗和预后提供新的突破口。

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