白族、彝族非综合征性耳聋人群SLC26A4基因突变分析*

林 垦，马 静，王美兰，李正才，娄 凡，毛志勇，张铁松，阮 标

(1.昆明市儿童医院耳鼻喉头颈外科，昆明 650228；2.昆明医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，昆明 650000)

SLC26A4基因位于人类染色体7q31，其mRNA全长4 930 bp，含21个外显子，开放阅读框架2 343 bp，编码780个氨基酸Pendrin。SLC26A4基因突变可导致常染色体隐性耳聋和Pendred综合征。非综合征型耳聋占所有遗传性耳聋的70%，这其中80%为常染色体隐性遗传。大前庭导水管综合征(enlarge vestibular aqueduct syndrome，EVAS)是常染色体隐性遗传性耳聋的常见类型。EVAS的发生与SLC26A4基因突变关系密切。云南目前少数民族聋病的分子遗传学的病因研究报道相对较少。本文针对云南地区白族、彝族非综合征型耳聋患者检测SLC26A4基因编码区的核苷酸序列变化，探索聋病的分子病因，为少数民族聋病的遗传咨询和预防提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象：采集2010年1月～2016年5月昆明市儿童医院耳鼻喉科门诊散发的234例白族、彝族中度、重度以上的非综合征型耳聋患者外周血，提取DNA。所有患儿经过临床检查均确诊为非综合征性中度、重度以上的感音神经性聋。包括132例白族，女性46例，男性86例，年龄10月～18岁；102例彝族，男性63例，女性39例，平均年龄8月～18岁。该研究经本院医学伦理委员会决议通过，家属签署知情同意书。

1.1.2 主要仪器和试剂：ABI 3730XL测序仪，美国ABI9700 PCR仪，Mass ARRAY微量点样系统以及试剂盒，美国Sequenom公司的Mass ARRAY DNA质谱阵列基因分析系统。

1.2 方法

1.2.1 临床资料采集：通过监护人及本人掌握被检测者的病史及家族史资料，其内容包括耳聋病史、家族史、聋儿出生史、个人史(耳毒性药物应用情况、头部外伤史)等。对所有耳聋患者进行全面的临床检查(颞骨CT和头颅MRI检查)和听力学评估(耳声发射、听性脑干诱发电位)，并抽取外周静脉血5ml以进行基因组DNA的制备及基因突变筛查。

1.2.2 飞行时间质谱(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)技术检测：采集患者5 ml外周静脉血液样本行备用检测，对样本提取DNA后行定量和纯度检测，引物扩增和延伸，利用虾碱式磷酸酶对PCR产物进行处理，以去除扩增反应中剩余的dNTP，产物纯化，去除盐离子。实验过程及数据统计由华大基因公司协助完成。

2 结果

2.1 TOF-MS检测 云南地区白族、彝族非综合征型耳聋人群中SLC26A4基因突变频率最高的位点为IVS7-2A>G，突变峰图见图1。

IVs7-2A→G纯合突变 IVs7-2A→G杂合突变

2.2 基因突变情况 132例白族、102例彝族非综合征型耳聋患者SLC26A4基因总突变率分别为9.09%和11.76%，其突变位点和突变方式见表1。281C→T，589G→A，1226G→A，1975G →C，2162C→T，2168A→G位点在白族、彝族被检人群中未发现有突变。

2.3 影像学检查 颞骨薄层高分辨率CT及头颅MRI检查，针对筛查出SLC26A4基因突变的患者进行影像学结果分析，对应其CT及MRI结果显示约42%的患者有前庭导水管扩大及内淋巴囊扩大(见图2)，24例SLC26A4基因突变患者中有10例颞骨CT显示双侧前庭导水管扩大及内淋巴囊扩大。

3 讨论

大量研究表明前庭导水管扩大性耳聋与SLC26A4基因突变有密切相关。71.9%的大前庭导水管综合征患者中可以发现SLC26A4基因突变，2%的正常人可携带SLC26A4基因突变，其影像学检查结果多显示前庭导水管或内淋巴囊扩大[1]。但耳聋基因突变在不同种族、不同地域有很大的差异[2]。因此研究云南地区少数民族耳聋患者易感基因的突变有重要意义。居住相对集中的白族和彝族人口基数大，取材相对其他少数民族较易，故针对白族和彝族耳聋人群基因进行调查分析。

表1 132例白族、102例彝族非综合征型耳聋患者SLC26A4基因突变情况(例)

注：突变率是IVs7-2A→G与1229C→T的和/132而来。

图2 A图为CT示左侧前庭导水管扩大明显；B图为MRI显示左侧内淋巴囊扩大

SLC26A4基因在中国突变频率最高的类型是IVS7-2A>G(纯合)[3]，IVS7-2A>G(杂合)[4](也称作c.919-ZA>G)位于外显子8剪切位点的位置，即内含子7的3’末端，其突变使前体mRNA不能正常剪接，外显子8整个丢失，外显子7和外显子9直接相连，从而导致Pendrin的翻译发生移框或提前终止，影响Pendrin的结构和功能。袁永一等[5]在对263例大前庭导水管患者进行SLC26A4基因热点突变区域筛查方案探讨时发现，除了已知的IVS7-2A>G外，中国人群中SLC26A4基因热点突变还包括IVSl5+5G→A，281C→T，2027T→A，589G→A，1174A→T，2168A→G，1226G→A，1229C→T，1975G→C，2162C→T。SLC26A4基因突变可导致前庭导水管扩大或伴其它内耳畸形。前庭导水管扩大综合征患者其SLC26A4基因在不同地区和国家突变类型也不尽相同。该研究应用飞行时间质谱技术对云南地区白族、彝族非综合征型耳聋人群SLC26A4基因的11个位点进行筛查，与其它基因检测方法比较，具有高通量、准确、覆盖率高、低成本等特点[7]。发现白族、彝族非综合征型耳聋人群SLC26A4基因突变的主要位点是IVS7-2A>G。其SLC26A4基因纯合突变的患者在听力障碍方面发病时间不一，听力损失水平也有极大的个体差异[8]，并且部分患者颞骨CT及MRI显示前庭导水管扩大及内淋巴囊扩大，这在前庭导水管综合征的分子病因及影像学诊断有高度一致性，对筛查出SLC26A4基因纯合突变、复合杂合突变的患者进行听力指导有重要意义。陈鑫苹等[8]报道的IVS7-2A>G突变其颞骨CT前庭导水管的影像学表现并不一致，可能在致聋病因中，存在其他基因突变可能。针对此种情况，本研究就影像确诊为前庭导水管综合征，而未明确SLC26A4分子病因的患者，需进一步行直接测序，筛查是否存在新的突变位点，以待发现少数民族SLC26A4基因新的突变特征。本研究采用的是对常见的目的基因进行检测，对发现少数民族耳聋基因新的突变位点存在缺陷，但是通过收集的病例检测证实IVS7-2A>G也是白族、彝族的主要突变位点。王艳莉等[9]在宁夏336例非综合征型聋学生中检测到IVS7-2A>G和2168A>G(H723R)等位基因频率分别为 9.08%和2.98%；贾婧杰等[10]在山东省滨州特教学校78名重度聋学生中检测到SLC26A4 IVS7-2A>G的携带率为5.13%。本次研究白族SLC26A4基因IVS7-2A>G突变率6.06%，彝族SLC26A4基因IVS7-2A>G突变率5.88%，未检出2168A>G(H723R)突变，IVS7-2A>G其突变率接近国内报道水平。由于耳聋病因学非常复杂，涉及的相关基因也非常之多，需要更多的临床数据归类总结。本次数据结果是针对昆明市儿童医院耳鼻喉科门诊就诊的散发白族、彝族耳聋患者，在今后的研究中需进一步补充数据。在临床中针对筛查出携带致聋基因突变的人群，对其婚配、用药和听力损失防护等方面可进行很好的干预和指导[11]。

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