辅助T细胞17及其相关调控因子在特应性皮炎患者中的表达情况及其临床意义▲

王鲁梅 曾碧冰 李俊杰 卢婉娇 张 斌

(广东省东莞市人民医院皮肤科，东莞市 523000，E-mail：wangluomei952@163.com)

论著·临床研究

辅助T细胞17及其相关调控因子在特应性皮炎患者中的表达情况及其临床意义▲

王鲁梅 曾碧冰 李俊杰 卢婉娇 张 斌

(广东省东莞市人民医院皮肤科，东莞市 523000，E-mail：wangluomei952@163.com)

目的 探讨辅助T细胞17(Th17)及其相关调控因子白细胞介素-23(IL-23)和微小RNA155(miR-155)在特应性皮炎(AD)患者外周血中的表达情况及其临床意义。方法 选择54例AD患者和30例健康对照者，检测受试者外周血白细胞中Th17比例、IL-23、miR-155的表达水平，分析3者诊断AD的敏感性和特异性以及3者与AD严重程度特应性皮炎评分(SCORAD)的相关性。结果 AD患者Th17比例、IL-23和miR-155表达水平均显著高于健康对照者(P<0.05)；Th17比例、IL-23和miR-155诊断AD的敏感性分别77.64%、65.30%和82.19%，特异性分别为62.81%、74.28%和77.06%；Th17比例、IL-23和miR-155表达水平均与SCORAD评分呈正相关(P<0.05)。结论 IL-23和miR-155可能参与了AD中Th17细胞的表达调控，Th17细胞及其相关因子尚不能作为AD的诊断指标，但可以辅助判断其疾病严重程度。

特应性皮炎；辅助T细胞17细胞；白细胞介素-23；微小RNA-155

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种具有遗传倾向的慢性、复发性瘙痒性皮肤病，以皮肤干燥、瘙痒和炎症为特点，同时伴有血清中IgE水平增高和嗜酸粒细胞增多，其发病机制极其复杂且至今未明[1]。辅助T细胞(T helper cell，Th)17作为近年来发现的一种重要免疫细胞，在多学科多种疾病的发病机制中受到广泛关注[2]。白细胞介素(interleukin，IL)-23和微小RNA(microRNA，miR)-155分别是Th17细胞的2个重要调控因素，其中IL-23作为调控细胞因子，通过促进Th17的生物活性，诱导其表达特异性效应因子IL-17而发挥病理作用，其在红斑狼疮、天疱疮和银屑病等多种皮肤病发病机制中的作用研究中均得到证实[3]。而miR-155作为调控Th17的微小蛋白质，目前已被证实是Th17分化所必需的miR之一[4]，目前有关在AD患者中是否也存在miR-155高表达并对Th17细胞进行调控鲜有文献报道。因此，本研究通过检测AD患者外周血中Th17及其2个重要调控因素IL-23和miR-155的表达情况，并分析其与疾病严重程度的相关性，以探讨3者在AD诊断和病情评估中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月至2015年5月在我院门诊就诊的AD患者54例，纳入标准：AD的诊断符合文献[5]中的诊断标准；患者检测前1周停止系统和外用糖皮质激素以及免疫抑制剂治疗，停用抗组胺药1周以上，无光疗1个月以上。排除标准：存在其他皮肤病或内脏疾病史者。其中男28例、女26例，年龄10～42(25.68±9.78)岁，病程9～32(17.68±6.54)年。选择健康志愿者30例作为健康对照组，其中男14例、女16例，年龄12～38(22.68±9.78)岁，均无家族和个人过敏史，无皮肤病或内脏病史。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究取得医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 标本采集 采集各组受试对象晨起空腹时的外周静脉血5 ml，440×g离心10 min，分离血浆，采用Ficoll密度梯度离心法分离、获取外周血浆和外周血单一核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，标本于-70℃保存待检。

1.3 Th17细胞检测 采用流式细胞仪检测外周血Th17比例(IL17+CD4+T细胞/CD4+T细胞%)：将PBMC放入含10%胎牛血清的RPMI 160培养液(美国Gibco公司，批号：GNM 31800)中并调整浓度至2×106细胞/ml，先后加人50 μg/L佛波酯、1 mg/L钙离子载体和10 mg/L布雷菲德菌素A(均购自美国Sigma公司，批号：FK-LM125)，37℃、5% CO2条件下共刺激培养5 h。首先细胞膜用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-CD4单克隆抗体标记，透膜、固定后PE-L17单克隆抗体细胞染色，染色步骤参考说明书进行(均购自美国eBioscience公司)。用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)检测标本，应用WinMDI2.9软件分析数据。

1.4 IL-23表达水平检测 采用酶联免疫吸附实验检测外周血IL-23的表达水平，酶联免疫吸附实验试剂盒购自美国eBioscience公司(批号：17992406)，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 miR-155表达水平检测 采用实时定量RT-PCR法检测外周血PBMC中miR-155的表达水平：用Trizol RNA提取试剂(美国Invitrogen公司，批号：RP2401)按说明书提取PBMC中的总RNA，紫外分光光度仪测定其纯度，吸光度值(A260/A280)在1.8～2.0之间为合格样本。利用miR-155茎环引物5′-GTCGTATC CAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCTAT-3′、内参U6反转录引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′及oligo(dT)，按M-MLV反转录试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：20D09H)说明书合成对应的cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(日本Toyobo公司，QPK-212)，并分别以U6和β肌动蛋白为内参照，引物序列为：(1)目的基因miR-155上游引物5′-TGCCTCCAACTGACTCCTAC-3′，下游引物 5′-GCGAGCACAGAATAATACGAC-3′。(2)内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCACACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT -3′。β肌动蛋白上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTC-3′，下游引物5′-TCACCTTC ACCGTTCCAGTTT-3′。在Rotor-Gene 3000实时PCR仪(澳大利亚Corbett Research公司)进行miR-155的定量检测。数据应用分析软件(Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0)和双标准曲线法进行分析。

1.6 病情程度的评价 采用欧洲AD研究组提出的特应性皮炎评分[6](scoring atopic dermatitis index，SCORAD)进行评估，包括客观体征皮肤病变范围(A)和皮损严重程度(B)，主观症状瘙痒和影响睡眠程度(C)，计分值计算公式为A/5+7B/2+C。

1.7 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料采用秩和检验；正态分布的资料采用Pearson相关性分析，非正态分布的资料采用Spearman相关性分析。3个指标的诊断效能分析采用受试者工作曲线进行。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组PBMC中Th17比例比较 AD患者PBMC中Th17细胞比例为(1.78±0.20)%，高于对照组的(0.47±0.20)%(t=12.145，P<0.001)。

2.2 两组IL-23和miR-155的表达水平比较 AD患者的IL-23及miR-155的表达水平均高于健康对照者(P<0.05)，见表1。

表1 AD患者和健康对照者IL-23和miR-155的表达水平(x±s)

2.3 相关性分析 AD患者中，Th17比例(r=0.415，P=0.034)、IL-23表达水平(r=0.577，P=0.036)、miR-155表达水平(r=0.426，P=0.011)均与SCORAD评分正相关；IL-23表达水平、miR-155表达水平均与Th17细胞比例呈正相关(r=3.577，P=0.036；r=6.426，P=0.049)。

12.4 Th17细胞比例、IL-23和miR-155的表达水平诊断AD的敏感性和特异性 Th17比例诊断AD的截断值为2.01%，曲线下面积为0.677，敏感性为77.64%，特异性为62.81%。IL-23水平诊断AD的截断值为374.55 pg/ml，曲线下面积为0.704，敏感性为65.30%，特异性为74.28%。PBMC中miR-155水平诊断AD的截断值为3.63，曲线下面积为0.813，敏感性为82.19%，特异性为77.06%。

3 讨 论

IL-23作为调控Th17的细胞因子，可诱导Th17细胞增殖、活化及终末分化，增加已分化细胞的数量，并在维持其生存及产生Thl7记忆形成中起关键作用，同时促进Thl7产生一定水平的IL-17[7-8]；IL-17可作为前炎性介质募集中性粒细胞等炎性细胞，诱发多种炎症损伤[7]。目前有研究已证实，AD患者外周血中Th17细胞、IL-17蛋白表达水平明显上调，且与病情严重程度呈正相关[9-10]。另有学者发现，在卵白蛋白诱导的小鼠AD模型中，皮肤树突细胞是表达IL-23的主要来源细胞[11]，IL-23是诱导皮肤初始T细胞分化为Th17细胞的关键因子[11]。这提示在AD患者中可能也存在IL-23的高表达并对Th17细胞存在正调控。

本研究结果显示，AD患者外周血中IL-23蛋白表达水平和Th17比例高于健康对照组(P<0.05)，且与病情的严重程度(SCORAD评分)呈正相关(P<0.05)，这一结果与国内文献报道相一致[9-10]；同时IL-23与Th17比例呈正相关(P<0.05)。这些结果表明，在AD患者高表达IL-23，高表达的IL-23对Th17存在正性调控，使Th17比例也相应上调，而Th17产生的IL-17可能也相应升高，IL-17作为前炎性介质可促进AD炎症反应发生，因此，随着病情的严重程度增加，两组的表达水平也随着升高。而高表达的IL-23病理机制形成可能是AD中因多种因素所致瘙痒、搔抓引起的皮肤机械损伤，诱发皮肤树突状细胞携带抗原从皮肤游走至淋巴结产生较多的IL-23[12]。

miR-155是一种多功能的miR分子，已被证实能够明显影响先天性免疫和适应性免疫过程，如炎症介导、抗原提呈、T细胞分化、细胞因子产生等[13]。miR-155为Th17分化所必需的因素，缺失miR-155的T细胞不能正常分化为Th17细胞[14]。本研究结果显示，AD患者外周血miR-155表达水平明显增高(P<0.05)，且表达水平与疾病严重程度评分呈正相关(P<0.05)；同时AD患者miR-155的高表达与Th17细胞比例呈正相关(P<0.05)。这些结果表明，在AD中高表达的miR-155也对Th17正性调控，使Th17比例相应上调，其表达水平随病情的加重而升高，提示miR-155参与AD的疾病发生过程。IL-23、miR-155虽均为Th17的调控因素，但二者在促进Th17分化和功能的调控机制上却存在着不同，且各为独立。IL-23作为细胞因子作用于Th17的受体发挥调控作用[8]。而细胞因子信号抑制物1是miR-155的直接靶基因，miR-155通过JAK/STAT信号途径抑制细胞因子信号抑制物1的表达，进而促进CD4+T细胞中Th17的分化与功能[15]。

本研究进一步分析了Th17比例、IL-23和miR-155作为诊断AD的可行性，但结果表明3者诊断AD的特异性和敏感性并不高，因此Th17细胞及其相关因子是否可以作为AD的诊断指标尚需进一步研究。但Th17比例、IL-23和miR-155与AD的SCORAD评分显著相关，因此临床可考虑将其作为判断疾病严重程度的客观指标之一。

综上所述，IL-23和miR-155可能参与了AD中Th17的表达调控，但Th17细胞及其相关因子尚不能作为AD的诊断指标，但可以辅助判断其疾病严重程度，因此在临床的应用中仍具有较好的前景。

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Expression and clinical significance of T helper cell 17 and its related regulatory control factors in patients with atopic dermatitis

WANGLu-mei,ZENGBi-bing,LIJun-jie,LUWan-jiao,ZHANGBing

(DepartmentofDermatology,DongguanPeople′sHospital,Dongguan523000,China)

Objective To explore the expression and clinical significance of T helper cell 17(Th17) and its related regulatory control factors including interleukin-23(IL-23) and microRNA-155(miR-155) in peripheral blood of the patients with atopic dermatitis(AD).Methods A total of 54 patients with AD and 30 healthy individuals were enrolled.Then the proportion of Th17 in peripheral leukocytes,and the expression levels of IL-23 and miR-155 in peripheral blood were detected in all participants.The sensitivity and specificity of the three factors for the diagnosis of AD were analyzed.And the correlation of the three factors with AD severity[scoring atopic dermatitis index(SCORAD)] was assessed.Results The proportion of Th17,and the expression levels of IL-23 and miR-155 of AD patients were significantly higher than those of healthy individuals(P<0.05).The sensitivities of proportion of Th17,IL-23 and miR-155 for the diagnosis of AD were 77.64%,65.30% and 82.19%,respectively,while the specificities were 62.81%,74.28% and 77.06%,respectively.The proportion of Th17,IL-23 and miR-155 expression levels positively correlated with SCORAD score (P<0.05).Conclusion IL-23 and miR-155 may be involved in regulating the expression of Th17 cell in AD.Th17 cell and its related regulatory factors still can not act as the diagnostic indicator for AD,but they are helpful for evaluating the severity of disease.

Atopic dermatitis,T helper cell 17,Interleukin-23,microRNA-155

广东省东莞市科技计划医疗卫生类科研项目(201410515000050)

王鲁梅(1972～)，女，硕士，副主任医师，研究方向：白癜风，特应性皮炎。

李俊杰(1964～)，男，硕士，主任医师，研究方向：皮肤美容，E-mail：RDPbird4451@163.com。

R 593.2

A

0253-4304(2016)03-0342-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.13

2015-12-19

2016-02-15)