磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3及热休克蛋白70在肝细胞结节性病变中的表达及意义▲

刘 莹 廖芝玲 向邦德

(广西医科大学附属肿瘤医院1 病理科，2 肝胆外科，南宁市 530021，E-mail：54570377@qq.com)

论著·基础研究

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3及热休克蛋白70在肝细胞结节性病变中的表达及意义▲

刘 莹1廖芝玲1向邦德2

(广西医科大学附属肿瘤医院1 病理科，2 肝胆外科，南宁市 530021，E-mail：54570377@qq.com)

目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、热休克蛋白70(HSP70)在局灶性结节性增生、肝细胞腺瘤、异型增生结节和高分化肝细胞癌组织中的表达及意义。方法 用免疫组化检测局灶性结节性增生21例、肝细胞腺瘤10例、低级别异型增生结节13例、高级别异型增生结节34例及高分化肝细胞癌32例患者病灶组织中GPC3、HSP70的表达。结果 GPC3在局灶性结节性增生、肝细胞腺瘤、低级别异型增生结节、高级别异型增生结节、高分化肝细胞癌组织中的阳性率分别为0、0、7.69%(1/13)、14.71%(5/34)、59.38%(19/32)。HSP70在局灶性结节性增生、肝细胞腺瘤、低级别异型增生结节、高级别异型增生结节、高分化肝细胞癌组织中的阳性率分别为9.52%(2/21)、0、0、20.59%(7/34)、62.5%(20/32)。高分化肝细胞癌组织的GPC3、HSP70阳性率均高于其他组织(P<0.05)，局灶性结节性增生、肝细胞腺瘤、低级别异型增生结节、高级别异型增生结节间GPC3、HSP70阳性率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GPC3、HSP70对鉴别良恶性肝细胞结节性病变有重要意义，但对非癌性结节性病变间的鉴别无意义。

肝癌；肝细胞结节性病变；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3；热休克蛋白70；良性病变；恶性病变；鉴别诊断

原发性肝细胞癌在我国恶性肿瘤中的发病率及死亡率分别为第4位和第2位[1]。广西是肝癌高发区，发病率高于全国水平[2]。多数原发性肝细胞癌患者就诊时病情已处于中晚期，错过了治疗的最佳时机。有研究表明亚洲肝癌患者总体5年生存率为42%，而早期肝癌患者的5年生存率为67%[3]。因此，及早发现肝癌，甚至于癌前病变期发现，对于将疾病止于癌前病变期、尽早获得治疗、提高治疗效果、降低死亡率、改善生命质量均有积极意义。

随着体检的普及，越来越多的肝细胞结节性病变在影像学检查中即被发现。常见的肝细胞结节性病变包括局灶性结节性增生、肝细胞腺瘤、异型增生结节和肝细胞癌。但对于体积较小的病变，影像学常难以明确诊断。而肝细胞结节性病变的正确诊断至关重要，其对于治疗方案的选择、预后的判断起到重要作用。而对于病理学诊断，有时仅凭形态学亦难以区分，需要免疫组织化学协助诊断。本研究应用免疫组织化学方法检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)在肝细胞结节性病变中的表达水平，评估其在肝细胞病变诊断中的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2010年7月至2015年6月在我院手术切除并经病理确诊的肝细胞结节性病变患者110例，其中男性79例、女性31例，年龄14～77岁，中位年龄50岁，所有患者均行手术治疗，手术前均未行放化疗。其中局灶性结节性增生21例、肝细胞腺瘤10例、低级别异型增生结节13例、高级别异型增生结节34例及高分化肝细胞癌32例；其中低级别异型增生结节11例和高级别异型增生结节24例为肝癌癌旁组织。5组的性别及年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 5组的性别及年龄比较

1.2 主要试剂 鼠抗人GPC3单克隆抗体，克隆号：1G12，购自北京中杉生物技术有限公司，即用型，规格：3ml/支，生产批号：15701B09。鼠抗人HSP70单克隆抗体，克隆号：W27，购自北京中杉生物技术有限公司，即用型，规格：3 ml/支，生产批号：15T41512。

1.3 GPC3、HSP70检测方法 GPC3、HSP70均采用SupervisionTM二步法进行检测。手术所取病变组织经10%甲醛固定6～48 h后，常规制成蜡块，3 μm连续切片，65℃烤片1 h，脱蜡，pH 8.0乙二胺四乙酸高压修复，3%过氧化氢阻断，分别滴加一抗，4℃孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液洗片后加酶标鼠兔通用型二抗室温孵育18 min，再经磷酸缓冲盐溶液洗片，二氨基联苯胺显色，苏木精衬染。

1.4 结果判断 GPC3阳性表达有3种模式，分别为胞膜阳性、胞浆阳性以及胞膜和胞浆均阳性。HSP70阳性表达定位于胞浆和胞核。二者均采用着色强度得分与阳性细胞率得分相加法进行染色评分。着色强度评分：无色评为0分，淡黄色评为1分，棕黄色评为2分，棕褐色评为3分。阳性细胞率评分：<10%细胞阳性评为0分，10%～25%细胞阳性评为1分，>25%～50%细胞阳性评为2分，>50%～75%细胞阳性评为3分，>75%细胞阳性评为4分。两项总分≤3分为阴性，>3分为阳性[4]。

1.5 统计学分析 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 5组组织标本镜下所见情况

2.2.1 局灶性结节性增生：多数病例大体可见特征性的中央星状瘢痕，镜下见放射状增生的纤维组织将肝细胞分割成多个结节，结节间纤维间隔中的厚壁小动脉伴淋巴细胞浸润具有特征性，缺乏肝小叶结构和汇管区，肝细胞无明显异型性。见图1。

图1 局灶性结节性增生镜下表现A：中央星状瘢痕，缺乏肝小叶结构和汇管区(苏木精-伊红染色，×50)；B：肝细胞无明显异型性(苏木精-伊红染色，×200)

2.1.2 肝细胞腺瘤：镜下可见2～3层肝细胞排列成梁索状或腺管状，肝窦受压。部分肝细胞腺瘤有轻度非典型增生。可有脂肪变性，炎细胞浸润，胆管反应，肝窦扩张，少数可见腺泡、腺管样排列，其中可见胆汁。见图2。

图2 肝细胞腺瘤镜下表现

A：病灶有完整包膜，无浸润，可见假腺管结构(苏木精-伊红染色，×50)；B：2～3层肝细胞排列成梁索状，肝窦受压，细胞分化好，异型性不明显(苏木精-伊红染色，×200)

2.1.3 异型增生结节：(1)低级别异型增生结节镜下表现为细胞密度轻度增加，有大细胞变，无明显结构异常，见图3A、图3B。(2)高级别异型增生结节镜下可见肝细胞兼具有细胞和组织学异型性，可有大细胞变、小细胞变、脂肪变、透明细胞变等，其中小细胞变是诊断的要点。细胞密度增高，肝板增厚，厚度为2～3层，小梁状结构不规则，可形成腺样结构，少数病例可出现非配对动脉及局灶性肝窦血管化。见图3C、图3D。

图3 异型增生结节镜下表现

A：低级别异型增生结节低倍镜下见细胞密度增加，无明显结构异常(苏木精-伊红染色，×50)；B：低级别异型增生结节高倍镜下见大细胞变(苏木精-伊红染色，×200)；C：高级别异型增生结节低倍镜下细胞密度显著增加，小梁状结构不规则，汇管区减少(苏木精-伊红染色，×50)；D：高级别异型增生结节高倍镜下见小细胞变，肝板增厚(苏木精-伊红染色，×200)

2.1.4 高分化肝细胞癌：镜下观癌细胞排列成梁索状，梁索间血窦清晰，肝板增厚，大于3层，癌细胞轻度异型，胞核较大，核浆比增高，核仁明显，偶可见核分裂象。见图4。

图4 高分化肝细胞癌镜下表现

A：大于3层肝细胞排列成梁索状(苏木精-伊红染色，×50)；B：细胞异型性较异型增生结节更为显著(苏木精-伊红染色，×200)

2.2 各组标本GPC3及HSP70的表达 GPC3在局灶性结节性增生、肝细胞腺瘤组织中不表达，在低级别异型增生结节及高级别异型增生结节组织中低表达，在肝细胞癌组织中高表达，见图5。HSP70在肝细胞腺瘤及低级别异型增生结节组织中不表达，在局灶性结节性增生及高级别异型增生结节组织中呈低表达，在肝细胞癌中表达显著高于非癌性病变，见图6。4组非癌性结节性病变组织GPC3及HSP70的表达阳性率均低于高分化肝细胞癌组织比较(P<0.05)，而4组非癌性结节性病变组织间GPC3、HSP70的表达阳性率两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组标本组织中GPC3及HSP70的表达(n，%)

注：与高分化肝细胞癌比较，*P<0.05。

图5 各组标本GPC3的表达情况(免疫组织化学染色，×200)

A：局灶性结节性增生组织GPC3阴性表达；B：肝细胞腺瘤组织GPC3阴性表达；C：低级别异型增生结节组织GPC3阴性表达；D：高级别异型增生结节组织GPC3阴性表达；E：高级别异型增生结节组织GPC3阳性表达；F：高分化肝细胞癌组织GPC3阳性表达。

图6 各组标本HSP70的表达情况(免疫组织化学染色，×200)

A：局灶性结节性增生组织HSP70阴性表达；B：肝细胞腺瘤组织HSP70阴性表达；C：低级别异型增生结节组织HSP70阴性表达；D：高级别异型增生结节组织HSP70阴性表达；E：高级别异型增生结节组织HSP70阳性表达；F：高分化肝细胞癌组织HSP70阳性表达。

3 讨 论

典型的肝细胞结节性病变仅凭形态学即可做出病理诊断，而在实际工作中，并非所有病例都十分典型，尤其是在肝硬化背景下，鉴别诊断变得十分困难，而对细针穿刺获取的组织进行鉴别则更具挑战。此时需要借助于免疫组织化学协助以明确诊断。GPC3是膜性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一员，在人类胚胎及胎儿期高表达，成人后仅在胎盘中高表达，少数组织低表达，在肝癌中高表达，而在正常肝组织、肝的非癌性病变中不表达或低表达[5]。HSP70是一种热休克蛋白，与肿瘤细胞的增殖相关，在肝癌的发生发展过程中HSP70的表达逐渐增高[6]，在肝细胞癌的表达明显高于肝脏的非癌性病变，因此有助于良恶性肝细胞结节性病变的鉴别。

局灶性结节性增生是肝的再生性病变，属良性病变，罕见恶变为肝细胞癌的报道。中央星状瘢痕是其特征性改变，镜下见放射状增生的纤维组织将肝细胞分割成多个结节，结节间纤维间隔中见厚壁小动脉伴淋巴细胞浸润，缺乏肝小叶结构和汇管区，肝细胞无明显异型性。有研究显示局灶性结节性增生组织的GPC3表达皆为阴性[7-8]，而本研究中21例局灶性结节性增生组织中GPC3亦均为阴性表达，与上述文献结果一致。有2例局灶性表达HSP70，但表达阳性率低于肝细胞癌组织(P<0.05)，与彭绍华等[9]的研究结果相符。

肝细胞腺瘤是肝上皮来源的良性肿瘤，但仍有极少数可恶变为肝细胞癌，国外研究结果显示该病多见于育龄妇女，其发生与长期口服避孕药或类固醇及某些代谢性疾病有关[10]。肝细胞腺瘤根据基因型或表型的不同，可分为4个分子亚型，其共同的形态学特征为镜下观可见2～3层肝细胞排列成梁索状或腺管状，无汇管和胆管结构。部分肝细胞腺瘤有轻度非典型增生，与肝细胞癌的鉴别有一定困难。本研究中，有1例肝细胞腺瘤大小为6 cm×4.2 cm×4 cm，有较多假腺管结构，内含胆栓，伴非典型增生，与高分化肝细胞癌难鉴别；后经上海东方肝胆外科医院会诊，认为该病例细胞分化较好，异型性不明显，有完整纤维包膜，无明显侵犯现象，免疫组化HSP70(-)，GPC3(-)，考虑为肝细胞腺瘤；但该病例的假腺管增多，提示增殖活跃，因此应注意有无癌变风险。多项研究表明肝细胞腺瘤不表达GPC3及HSP70[7-8，11]，与本研究结果一致。

异型增生结节是发生在肝大面积损伤(如肝硬化、肝炎)基础上发生的再生结节，可分为低级别异型增生结节和高级别异型增生结节。低级别异型增生结节细胞密度轻度增加，有大细胞变，无明显结构异常。低级别异型增生结节预后良好，仅需随访，而无需立即处理[12]。高级别异型增生结节肝细胞兼具有细胞和组织学异型性，但不足以诊断为肝细胞癌，可有大细胞变、小细胞变、脂肪变、透明细胞变等，细胞密度增高，肝板增厚，厚度大于2层，小梁状结构不规则，可形成腺样结构。高级别异型增生结节与肝细胞癌关系密切，属交界性病变，对两者的鉴别诊断曾存在分歧，而在2008年多国专家共同组成肝细胞肿瘤国际共识小组，才确定间质浸润为鉴别诊断的关键点[13]。Coston等[8]的研究则显示GPC3在低级别异型增生结节表达的敏感度为7.0%，而高级别异型增生结节为23.0%，而本研究中，在13例低级别异型增生结节中仅1例出现局灶性表达GPC3(7.69%)，在高级别异型增生结节中阳性率为14.71%。Di Tommaso等[14]的研究发现HSP70在高级别不典型增生结节的阳性率为5%，低级别不典型增生结节没有阳性表达，而在本研究中两者HSP70的阳性率则分别为20.59%和0%。本组高级别异型增生结节组织的GPC3及HSP70阳性率高于以上文献的结果，但仍低于在肝细胞癌中的阳性率(P<0.05)。

此外，本研究结果显示，4组非癌性结节性病变组织间GPC3、HSP70的表达阳性率两两比较，差异均无统计学意义(P<0.05)，提示GPC3、HSP70对非癌性结节性病变间的鉴别可能无意义。

综上所述，GPC3、HSP70在肝细胞结节性病变良恶性的鉴别中的应用具有重要意义，但对于具体病例良恶性的鉴别，即使GPC3、HSP70均为阴性仍不能排除肝细胞癌的可能，需结合形态学以明确诊断，多个指标的联合应用有助于进一步提高诊断的准确性[15]。

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Expression and significance of glypican-3 and heat shock protein 70 in hepatocellular nodular lesions

LIUYing1,LIAOZhi-ling1,XIANGBang-de2

(1DepartmentofPathology,2DepartmentofHepatobiliarySurgery,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the expression and significance of glypican-3(GPC3) and heat shock protein 70(HSP70) in focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,dysplastic nodule and well-differentiated hepatocellular carcinoma tissues.Methods The expressions of GPC3 and HSP70 were detected in the tissues of focal nodular hyperplasia(n=21),hepatocellular adenoma(n=10),low-grade dysplastic nodule(n=13),high-grade dysplastic nodule(n=34) and well-differentiated hepatocellular carcinoma(n=32).Results The positive expression rates of GPC3 in focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,low-grade dysplastic nodule,high-grade dysplastic nodule and well-differentiated hepatocellular carcinoma tissues were 0,0,7.69%(1/13),14.71%(5/34) and 59.38%(19/32) respectively.The positive expression rates of HSP70 in focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,low-grade dysplastic nodule,high-grade dysplastic nodule and well-differentiated hepatocellular carcinoma tissues were 9.52%(2/21),0,0,20.59%(7/34) and 62.5%(20/32) respectively.The positive expression rates of GPC3 and HSP70 in the well-differentiated hepatocellular carcinoma tissue were higher than the rates in the other tissues(P<0.05).There was no statistical difference in the positive expression rate of GPC3 or HSP70 among focal nodular hyperplasia,hepatocellular adenoma,low-grade dysplastic nodule,high-grade dysplastic nodule tissues(P>0.05).Conclusion GPC3 and HSP70 have an important significance in differentiating benign hepatocellular nodular lesions from malignant hepatocellular lesions,but have no significance in differentiating among benign hepatocellular nodular lesions.

Hepatocellular adenoma,Hepatocellular nodular lesion,Glypican-3,Heat shock protein 70,Benign leision,Malignant leision,Differential diagnosis

国家自然科学基金(81260331/H1607)

刘莹(1985～)，女，在读硕士研究生，研究方向：消化道肿瘤的诊断。

廖芝玲(1963～)，女，博士，教授，研究方向：消化道肿瘤的诊断，E-mail：54570377@qq.com。

R 735.7

A

0253-4304(2016)03-0297-05

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.03.01

2016-01-04

2016-03-11)