禽致病性大肠杆菌的分离、O血清群鉴定及药物敏感试验

马兴树，朱美霞，石 虎，杨广平

（1.河北工程大学农学院分子生物学实验室，邯郸056021；2.河北科星药业有限公司河欣科技中心，石家庄050200）

禽致病性大肠杆菌的分离、O血清群鉴定及药物敏感试验

马兴树1，朱美霞1，石 虎2，杨广平2

（1.河北工程大学农学院分子生物学实验室，邯郸056021；2.河北科星药业有限公司河欣科技中心，石家庄050200）

摘 要：对2005年5月～2016年3月自河北、山东、河南、江苏、陕西、辽宁等省发病鸡场疑似大肠杆菌病的病死鸡病变部位分离的194株禽致病性大肠杆菌进行了生化特性测定、O抗原血清群鉴定及药敏试验。试验用5种大肠杆菌单因子（O1、O2、O57、O65、O78）阳性血清进行O血清群鉴定，确定了124株O血清群，占鉴定菌株数的63.9%（124／194），其中O1 3株、O2 26株、O57 15株、O65 47株和O78 33株，O65和O78为优势菌株，而O2和O57血清群菌株次之，O1血清群菌株最少。8种药物（氨苄西林、新霉素、多西环素、磺胺间甲氧嘧啶、替米考星、环丙沙星、头孢噻呋和氟苯尼考）的药敏试验结果表明，受试的5株大肠杆菌分离株均对环丙沙星和新霉素敏感，而对其他药物均有不同程度的耐受。本研究结果表明O65、O78、O2和O57血清群高度流行，为进一步研发多价菌苗奠定了基础。

关键词：禽致病性大肠杆菌；分离；鉴定；O血清群；药物敏感试验

鸡大肠杆菌病是由某些血清群禽致病性大肠杆菌（APEC）引起鸡局部或全身性感染的不同类型的总称，临床实践中以肝周炎、心包炎、气囊炎和脐炎等较为常见，给养鸡业造成巨大的经济损失［1］。中国自1982年以来，许多省市相继报道了鸡的大肠杆菌病，其普遍性和严重性及对养鸡业发展构成的威胁越来越严重［2］。目前，随着中国养鸡业的快速发展，鸡大肠杆菌病的发生也愈来愈受到养鸡者的关注。为探明大肠杆菌病在中国部分养鸡集中地区的发生和流行情况，作者对2005年5月～2016年3月自河北、山东、河南、江苏、陕西、辽宁等省不同发病鸡群分离的194株致病性大肠杆菌进行了生化特性测定、O血清群鉴定、药物敏感试验等研究，为进一步研发多价或亚单位疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1病料来源及大肠杆菌分离培养

2005年5月～2016年3月，自河北、山东、河南、江苏、陕西、辽宁等省不同发病鸡群，无菌采取临床症状典型（如败血症、脑炎、眼结膜炎）或剖检有明显病变（如肝周炎、心包炎）的病死鸡肝脏和心血或脑、眼分泌物，分别接种于伊红美蓝（EMB）琼脂平板、麦康凯琼脂平板、营养琼脂平板，置37℃培养箱中培养18～24h后，观察菌落大小、形态、色泽，透明度等，同时挑取营养琼脂平板上的单个菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检［2］。共分得194株APEC，其中蛋鸡138株、肉鸡56株；分离自肝脏和心血185株、眼分泌物2株、脑7株。

1.2生化试验

细菌微量生化反应管购自浙江省杭州天和微生物试剂有限公司。按使用说明分别接种至硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、靛基质、甲基红、枸缘酸盐、尿素、动力、产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木糖等15种生化常规微量鉴别管，置于37℃培养箱中培养16～18h后，观察各个鉴别管中的变化情况，根据说明书判定结果。

1.3O抗原制备及血清群鉴定

将纯化的大肠杆菌分别接种于营养琼脂平板，37℃下培养18～24h后，用2～3mL 0.5%的灭菌石炭酸生理盐水冲洗，收集菌悬液放入灭菌的西林瓶中，硫酸纸封口，121℃高压灭菌2h，冷至室温，加入1%NaN31～2滴，置于4℃冰箱内保存备用。大肠杆菌O抗原单因子血清购自中国兽医药品监察所，共5种，分别为O1、O2、O57、O65和O78。取制备好的抗原30μL滴在洁净的玻片上，再滴加等量已知单因子血清，用牙签使其充分混合，1min后判定结果。

1.4药敏试验

分别自5种血清群各选取1株典型的分离菌进行氨苄西林（10μg／片）、新霉素（30μg／片）、多西环素（30μg／片）、磺胺间甲氧嘧啶钠（300μg／片）、替米考星（5μg／片）、环丙沙星（5μg／片）、头孢噻呋（30μg／片）和氟苯尼考（30μg／片）等8种药物进行药物敏感试验（药敏片为河欣科技中心公司制备），采用纸片扩散法，参考文献［2］进行。

2 结果与分析

2.1镜检及培养特性

挑取营养琼脂平板上37℃培养18h的单个菌落涂片，革兰氏染色后，镜检可见大量革兰氏阴性的短小杆菌（图1）。伊红美蓝琼脂培养基上多数分离菌株呈紫黑色，并带有明显的金属光泽；麦康凯琼脂培养基上呈粉红色；营养琼脂培养基上呈1.5～2mm形态突起，光滑湿润，灰白色，半透明，边缘整齐，并具有特殊的鸡粪样臭味（图2）。

图1　APEC菌株O78（115＃）革兰氏染色涂片（1 000×）Fig.1 Gram stain of APEC isolate O78（115＃）（1 000×）

图2　APEC菌株O78（115＃）在3种培养基上的生长表现Fig.2 Growth characteristics of APEC isolate O78（115＃）on three kinds of culture medium

2.2生化特性

对5株菌株进行生化试验，结果表明所选取的5株菌株均发酵赖氨酸、木糖，产生靛基质，MR阳性，不产生H2S、不发酵苯丙氨酸、葡萄糖酸盐，在枸缘酸盐培养基不生长，不水解尿素（尿素酶阴性），无动力，不产气，158＃（O57）和102＃（O65）菌株不利用鸟氨酸，77＃（O1）、57＃（O2）和158＃（O57）不利用棉子糖（表1）。

表1　5株APEC分离菌株生化试验结果Table 1 Biochemical characteristics of five APEC isolates

2.3O抗原血清群鉴定

试验用5种单因子O血清对所分离的194株禽致病性大肠杆菌进行鉴定，共鉴定出124株，分别为O1（3株）、O2（26株）、O57（15株）、O65（47株）和O78（33株），鉴定菌株占分离菌株数的63.9%（124／194）。其中O65、O78和O2为优势菌株，占定型菌株的85.5%（106／124）。

从菌株分离年代来看，每年的优势菌株变化较大，如2009－2012年以O2、O65和O78为主，而2013－2016年则出现O57菌株。2005－2016年5种血清群在蛋鸡和肉鸡的分离株数见表2。

2.4 药敏试验

5株APEC对环丙沙星和新霉素敏感，而对其他药物均呈不同程度耐受，特别是氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶和替米考星（表3），表明这3种药物临床使用较为普遍，应引起临床兽医工作者重视。

表3　5株APEC的药物敏感试验结果（mm）Table 3 Drug sensitivity results of five APEC strains

3 讨 论

禽致病性大肠杆菌是引起鸡发病和死亡的重要致病菌，也是导致家禽业巨大经济损失的主要原因［3］。作者对2005年5月～2016年3月自河北、山东、江苏、陕西、辽宁等省不同鸡群发生不同病型（肝周炎、心包炎、脑炎、眼结膜炎等）的病死鸡分离的194株大肠杆菌进行了形态特征、培养特性及生化特性鉴定，结果表明均符合致病性大肠杆菌特性［2］。

目前根据大肠杆菌表面结构（O抗原、H抗原和K抗原）的抗原性将其分为不同的血清型（O∶K∶H）。然而，由于多数实验室不能对K抗原定型，故基于O和H抗原（O∶H）作为血清型（serotype）分型的“金标准”，而单依据O抗原则定为血清群（serogroup）［4］。在前期研究工作的基础上［5］，选取O1、O2、O57、O65和O78 5种单因子血清对近年野外分离的194株大肠杆菌进行鉴定，共定群124株，定群率为63.9%，其中O65、O78和O2为优势菌株，占定型菌株的85.5%，而国外报道的优势菌株O1仅占1.5%［6］。血清群O57和O65国内虽有报道，但其所占比例不完全一致，表明禽致病性大肠杆菌血清群分布具有明显的区域性特点［7］。然而，O血清群的多样性除与地域和宿主有关外，也随着感染年代的不同而改变［8］。一般来说，某一地区的优势血清群通常为3～5种，但其多样性却极为丰富，某一地区的优势血清群可能是另一地区少见或罕见的血清群，反之亦然，这给通过疫苗防控禽大肠杆菌病带来极大困难［9－11］。

值得注意的是，在定群菌株中，尽管优势菌株O65均分离自发病鸡群，但人工接种1日龄易感雏鸡却无致病性，特别是自表现神经症状的患鸡脑部分离到的7株APEC，除4株未定群外，其他3株均为O65血清群，这是否与自然条件下低致病性或无致病性APEC受病毒、支原体感染及环境条件较差等促发因素有关，尚需深入研究［12－14］。然而，本试验于2013～2016年分离的血清群O57菌株在国内外的报道很少，但其致病性却很强，应引起禽病研究者特别是养禽生产者的高度关注。

在试验过程中还发现有18株未定群菌株存在自凝现象，其原因可能与粗糙型大肠杆菌有关；有些菌株可与2种单因子血清同时发生凝集，如于2014年自邱县某鸡场150日龄发病蛋鸡肝脏分离的菌株，可与血清群O57、O78同时发生凝集，这是否与菌体自身就存在两种O抗原有关，值得进一步通过分子生物学方法研究阐明［4］。在临床实践中，还发现即使同一鸡场、同一鸡群甚至同一只病死鸡不同组织器官（肺脏、气囊、心血、肝脏）所分离到的血清群有时亦不完全一致，表明鸡大肠杆菌血清群不仅与鸡苗来源有关，更与饲料、饮水及鸡场环境甚至饲养人员有关［15－18］。

药敏试验结果表明，不论是同一地区的同一血清群或不同血清群还是不同地区的同一血清群或不同血清群对同一种药物的敏感性可能相同，也可能不同，其原因可能与用药历史不同或细菌在传代过程中质粒丢失或增加，使其耐药性降低或提高有关［7，19］。本试验对5株（O1、O2、O57、O65和O78）耐药菌株和敏感菌株的质粒电泳图谱初步分析表明，不同菌株的质粒种类和数量明显不同，但与药敏特性密切相关，而与血清群无关［18，20］。然而不论所含质粒种类和数量多少、来源何地的菌株，均对环丙沙星和新霉素呈现不同程度的敏感性，故在初步诊断为大肠杆菌病后结合临床用药史可先行使用这类药物予以治疗。

4 结 论

对野外发病鸡群分离的194株APEC的初步研究结果表明，优势血清群O78和O2与国内外报道一致，优势血清群O65和O57则报道较少。因此，特殊或罕见的血清群可能因地、因时、因禽而异。尽管不同血清群APEC具有共同的毒力因子或毒力基因，但在感染的不同阶段涉及的毒力因子不同，如O2和O78血清群均具有黏附菌毛，但前者为P菌毛，后者则为AC／Ⅰ菌毛，而不同的菌毛其抗原性也不同。由此可见，分离鉴定的O65和O57优势血清群，拓展了中国APEC血清群范围，为进一步研发多价或亚单位疫苗奠定了物质基础。

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（责任编辑 秦 彤）

中图分类号：S858.3

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3343－06

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.038

收稿日期：2016－05－12

基金项目：河北省科技厅科技支撑计划项目（13226602D）

作者简介：马兴树（1963－），男，河北张家口人，博士，教授，研究方向：动物传染病防制与病原微生物分子生物学，E－mail：maxingshu＠126.com

通信作者：＊杨广平（1956－），男，高级畜牧师，E－mail：ygpdml＠gmail.com

Isolation，O Serogrouping and Drug Sensitivity Test of Avian PathogenicEscherichiacoli

MA Xing－shu1，ZHU Mei－xia1，SHI Hu2，YANG Guang－ping2
（1.LaboratoryofMolecularBiology，CollegeofAgricultural，HebeiUniversityofEngineering，Handan056021，China；2.HexinScientificandTechnologicCenterofHebeiKexingPharmaceutical Co.，Ltd.，Shijiazhuang050200，China）

Abstract：One hundred and ninety four avian pathogenicEscherichia.coli（APEC）isolated from different pathotypes of chickens in Hebei province，Shandong province，Henan province，Jiangsu province，Shanxi province and Liaoning province in China between May 2005and March 2016were investigated by determination of biochemical characters，O serogroup identification and drug sensitivity test.Out of 194isolates，124strains（63.9%）could be grouped to serogroups O1（3），O2（26），O57（15），O65（47）and O78（33）.The drug sensitivity test used eight antibiotics（ampicillin，neomycin，doxycycline，sulfamonomethoxine，tilmicosin，ciprofloxacin ceftiofur and florfenicol）by one strain of O1，O2，O57，O65，O78serogroup，respectively.The results showed that all strains were sensitive to ciprofloxacin and neomycin，and resistance to other drugs at varying degrees.This study demonstrated that the high prevalence of O65，O78，O2and O57isolates existed and provided the basis for the development of multivalent bacterin in future.

Key words：avian pathogenicE.coli；isolation；identification；O serogroups；drug sensitivity test