奶牛乳房炎白色念珠菌的分离鉴定及生物学特性研究

何 芳，卢金霞，冯 峰，周学章，2＊

（1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川750021；2.宁夏智弘生物科技有限公司，银川750021）

奶牛乳房炎白色念珠菌的分离鉴定及生物学特性研究

何 芳1，卢金霞1，冯 峰1，周学章1，2＊

（1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川750021；2.宁夏智弘生物科技有限公司，银川750021）

摘 要：试验旨在了解宁夏地区奶牛真菌性乳房炎的发生情况，为诊断和治疗真菌性奶牛乳房炎提供有效依据。采集宁夏周边地区各奶牛场使用抗生素治疗无效的乳房炎奶样，对奶样中的真菌进行分离鉴定，并对分离菌进行生物学特性研究。通过选择性培养基从乳房炎奶样中获得真菌，进一步应用生物化学和分子生物学手段鉴定出样品中的真菌为白色念珠菌。通过溶血性、磷脂酶活性及产膜等方面的研究，证实其具有不同毒力，分离菌株对试验动物有较强的致病性。同时，采用药敏纸片法对分离株进行药敏试验，结果显示，菌株对临床常用抗生素耐药，对临床常用抗真菌药物敏感。结果表明，宁夏地区真菌性乳房炎奶样中分离出的致病菌均为白色念珠菌，感染率为43%，分离株具有较强的毒力，对常用抗生素耐药，对抗真菌药物和中药敏感。

关键词：白色念珠菌；乳房炎；致病性；溶血性

随着广谱抗生素的广泛应用，奶牛真菌性乳房炎呈上升趋势，真菌性乳房炎多由白色念珠菌引起，主要由被白色念珠菌污染的灌注导管、注射器或经多次乳房灌注引起［1］。白色念珠菌是一种人畜共患的深部条件致病性真菌，具有较强的毒力和致病性。其毒力主要表现为对环境变化的适应性、对宿主细胞的黏附作用及分泌胞外磷脂酶、分泌型酸性蛋白酶等水解酶。研究发现白色念珠菌产生的胞外磷脂酶能分解宿主细胞的膜磷脂，使宿主细胞膜通透性增加、完整性受损，从而促进白色念珠菌的入侵。溶血素是白色念珠菌在感染过程中的另一毒力因子，能使病原微生物破坏亚铁血红素提取铁元素的能力，这种破坏能力在感染过程中非常重要［2］。

正常情况下，奶牛乳腺中的正常菌群能对真菌的生长繁殖产生抑制作用，使用抗生素治疗能将细菌杀灭但白色念珠菌生长更旺盛。尤其连续长期使用抗生素或联合使用抗生素治疗更有利于白色念珠菌的感染，从而造成乳腺菌群失调，导致真菌感染［3－4］。因此，真菌性乳房炎常继发于抗生素治疗不当的急性细菌性乳房炎，且由于被确诊时已使用抗生素，给后续治疗带来极大困难，此类奶牛通常面临淘汰，给奶牛养殖业带来巨大损失。此外，由于白色念珠菌具有很强的形成生物膜的能力，增强了病原微生物抵抗宿主免疫反应的能力，很大程度上减弱了抗菌药物的治疗效果，易造成持续性感染［5］。研究结果表明，白色念珠菌形成生物膜后，比其浮游状态对抗真菌药物的耐药能力增强30～2 000倍。目前，人医临床上常用的抗真菌药物5－氟胞嘧啶（FC）、伊曲康唑（ITC）、特比奈芬（TER）、两性霉素B（AMB）等对白色念珠菌具有较好的抗菌能力，但这些药物不能应用于兽医临床。在奶牛乳房炎的治疗方面，国内外普遍使用抗生素进行乳房灌注的给药治疗方式，由于药物使用特点及挤奶、用药消毒不严格等因素，对抗生素治疗无效的顽固性乳房炎越来越多。

兽医临床尚无抗真菌的乳房灌注制剂，在治疗奶牛真菌性乳房炎和基础研究方面尚处于空白。本试验研究白色念珠菌对药物的敏感性、毒力与致病性，以期为及时准确给出治疗方案、研制新型乳房灌注剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1样品及试验动物

无菌采集抗生素治疗无效或反复发作的病牛奶样23份，临床检查时发现乳房发红肿胀、变硬，乳汁异常，产奶量显著降低，有时出现水样乳或血样乳。将乳房进行消毒，弃去头3把奶，随机采集病牛4个乳区的混合奶样10mL，并做好标记。人源白色念珠菌标准株SC5314由宁夏医科大学附属医院实验中心惠赠。33只体重20g±2g清洁级小鼠由宁夏医科大学动物实验中心提供。

1.2培养基与试剂

孟加拉红培养基、玉米吐温琼脂培养基、TTC－沙堡罗培养基、糖发酵基础肉汤均购自青岛海博生物技术有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；脱纤维羊血培养基购自江莱生物科技有限公司；环丙沙星、青霉素、庆大霉素均购自中国药品生物制品检定所；双黄连由宁夏智弘生物科技有限公司提供；5－氟胞嘧啶（FC）、伊曲康唑（ITC）、特比奈芬（TER）、两性霉素B（AMB）均购自Sigma公司；XTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

蛋黄琼脂培养基配制：分别称取6.36g NaCl、0.06g CaCl2、4g葡萄糖、1.0g蛋白胨、1.8g琼脂粉溶于100mL蒸馏水，高压灭菌，冷却至55℃左右，加入20mL经巴氏消毒的无菌蛋黄［6］。

菌液制备：无菌生理盐水将待检菌株制成菌悬液，用麦氏比浊仪调整至2个麦氏单位。

1.3病原菌的分离与鉴定

1.3.1病原菌的初步分离 将无菌采集的23份奶样先接种于LB液体培养基和马丁氏液体培养基，37℃摇床培养24～48h后，接种于TTC－沙堡罗培养基、孟加拉红培养基和LB固体培养基上，37℃培养48～72h后，分别进行美蓝染色和革兰氏染色，镜检，初步确定真菌感染的奶样，并斜面4℃保存待用。

1.3.2生化鉴定试验 将疑似真菌的待检菌株及白色念珠菌标准株（浓度调整为1×105CFU／mL）分别接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖生化反应管（小试管内预先套有倒置的杜氏小管，在糖发酵基础肉汤中分别加入葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，使各类糖的最终浓度为0.5%）。在37℃条件下培养24h，观察各试管颜色变化及杜氏小管中有无气泡。

1.3.3PCR扩增试验 PCR反应的特异性引物是根据白色念珠菌ITS1－ITS2部分的保守序列设计［7］，引物序列：上游引物：5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′；下游引物：5′－GCT－GCGTTCTTCATCGATGC－3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系20μL：2×PCR缓冲液10μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，蒸馏水补至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min。反应完成后，取5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.4芽管和厚膜孢子形成试验 接种环蘸取待鉴定菌落（浓度调整为1×105CFU／mL）接种于0.5mL的胎牛血清中，涡旋混匀器振荡3min后，于湿盒中37℃孵育2～3h，取出1滴滴于载玻片上，镜检是否有芽管形成，牙管是在酵母相转变为菌丝相过程中形成的，是转变为致病菌的标志［8］。取适量玉米吐温琼脂培养基置于洁净玻片上，将待检菌株水平方向穿刺接种，置潮湿平皿中，25℃孵育24～48h，镜检厚膜孢子形成情况。

1.4分离菌株的毒性鉴定试验

1.4.1磷脂酶活性检测及判定 在蛋黄琼脂培养基上轻轻放置6mm的无菌滤纸片，滴加6μL菌液于滤纸片上，37℃培养72h。白色念珠菌SC5314菌株为对照菌株。透射光下，滤纸片附近可观察到界限清晰的白色致密沉淀环。磷脂酶活性（PZ值）＝菌落直径／总直径（菌落＋沉淀环）。PZ值的大小与酶活性成反比，将PZ值分类：0＜PZ≤0.50为高活力，0.51≤PZ≤0.74为中等活力，0.75≤PZ≤0.99为低活力，PZ＝1者为磷脂酶阴性［9］。试验重复3次。

1.4.2溶血性检测及判定 菌悬液滴于羊血培养基上，在37℃培养48h。溶血性阳性的菌株可见半透明、与菌落同圆心的溶血环，测定菌落直径和总直径（菌落＋溶血环）。溶血指数（HI指数）＝菌落直径／总直径，HI值愈小，则溶血活性愈高，致病性越强［10］。对照菌株同上，试验重复3次。

1.4.3生物膜形成能力测定 用YPD（2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）培养基将保存的待检菌株扩大培养后，菌液浓度调整为1×105CFU／mL，取100μL接种于96孔板，37℃培养48h后，弃去上清，用PBS轻轻冲洗3次，除去浮游菌。最后每孔加50μL甲基四氮盐（XTT），37℃避光培养2h后，酶标仪测定波长为450nm处各个孔的值。试验重复3次。

1.5动物致病性试验

将小鼠随机分成11组，每组3只。无菌生理盐水将待检菌株制成5×105CFU／mL的菌悬液，小鼠腹腔注射0.5mL，1次／d，连续2d。接种后每日观察发病情况，待动物死亡或30d后处死剖检，分别取小鼠肝脏、脾脏、肾脏、肺脏用于真菌分离培养。将分离出的真菌染色观察，并进行糖发酵试验、PCR扩增试验与毒性试验，以鉴定分离出的真菌是否仍为白色念珠菌及其生物学特性是否发生变化。

1.6分离菌株及标准株的药敏试验

选用常用抗真菌药物FC、ITC、TER和AMB，常用抗生素环丙沙星、青霉素、庆大霉素及自制中药双黄连药敏纸片进行药物敏感性试验，按照Kirby Bauer琼脂扩散法进行操作，观察抑菌圈大小。

1.7数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。应用One－Way ANOVA进行方差分析，统计显著水平为P＜0.05，数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1病原菌的分离鉴定结果

2.1.1白色念珠菌初步分离结果 只在孟加拉红培养基上有菌落形成的奶样共10个，编号为1～10。在油镜下观察，美蓝染色为蓝紫色，菌体呈圆形或椭圆形（图1A、1B）；革兰氏染色结果为革兰氏阳性单细胞真菌，菌体大小不一，呈卵圆形、椭圆形或棒状，有芽生孢子但着色不均（图1C、1D）。在TTC－沙堡罗培养基上培养，形成边缘光滑整齐、隆起呈半球形的乳脂状，稍有酒糟味菌落；在孟加拉红平皿上培养24～48h后，菌落呈乳白色凸起，边缘整齐的菌落。分离的病原菌染色结果、菌体形态、菌落特征均相似，符合白色念珠菌的典型特征。

图1　白色念珠菌分离株染色结果（1 000×）Fig.1 The stain results ofCandidaalbicans（1 000×）

2.1.2生化鉴定试验结果 37℃培养24h后，分离株能发酵葡萄糖、麦芽糖和半乳糖，产酸并产气；不发酵蔗糖和乳糖，与标准株的试验结果一致。

2.1.3PCR扩增试验结果 由图2可知，菌株ITS1－ITS2区域的PCR产物约250bp，临床分离株扩增的条带与标准株的条带一致。

图2　ITS1－ITS2区域的PCR扩增产物Fig.2 PCR amplified product of ITS1－ITS2

2.1.4芽管和厚膜孢子形成试验结果 经湿盒37℃孵育2～3h后，镜检发现有芽管形成（图3A）。潮湿平皿中，25℃孵育24～48h后，美蓝染色镜检发现在玉米吐温琼脂培养基上有厚膜孢子形成（图3B～3D）。

图3　芽管和厚膜孢子形成试验结果（1 000×）Fig.3 The results of germ tube and chlamydospores tests（1 000×）

2.2毒性鉴定试验结果

2.2.1磷脂酶活性及溶血性测定结果 由表1可知，白色念珠菌分离株HI值为0.69±0.03，标准株SC5314的HI值为0.42±0.03，可见分离株的溶血性显著低于标准株（P＜0.05）。分离株PZ值为0.57±0.08，标准株SC5314的PZ值为0.61± 0.04，可见白色念珠菌的分离株具有较高的磷脂酶活性，但与标准株相比无显著差异（P＞0.05），表明白色念珠菌具有较强的毒力和致病性。

表1　酶活测定试验结果Table 1 The results of the determination of enzyme activity

2.2.2生物膜形成能力测定结果 在96孔板上构建生物膜，采用XTT减低法观察白色念珠菌分离株及标准株的成膜能力，结果见表2。由表2可知，白色念珠菌具有较强的形成生物被膜的能力，各个分离株的成膜能力差异较大。

表2　白色念珠菌生物膜形成能力测定结果Table 2 The result of biofilm－forming abilities

2.3动物致病性试验结果

注射白色念珠菌的小鼠于第10～12天死亡，剖检可见肾脏、肝脏等器官有白色小肉芽肿状的病灶。分别取肝脏、脾脏、肾脏和肺脏等组织作真菌分离培养，经染色镜检、糖发酵试验和PCR扩增试验鉴定分离得到的真菌仍是白色念珠菌，且毒性与原分离株相比几乎无变化。

2.4药敏试验结果

两性霉素B、特比奈芬、双黄连对病原菌具有较好的抗菌活性，可以作为抗真菌首选药物。病原菌对5－氟胞嘧啶、伊曲康唑中度敏感。环丙沙星、青霉素、庆大霉素对病原菌的抑菌效果不理想，甚至无抑菌作用。具体结果见表3。

表3　药敏试验结果Table 3 The result of drug sensitive tests

3 讨 论

宁夏周边牧场经抗生素治疗无效的奶样感染情况复杂，有细菌和真菌的单独感染，也有二者的混合感染。凌丁等［11］调查发现奶牛的病原菌感染也以混合感染为主。本试验调查结果显示，宁夏周边地区真菌性奶牛乳房炎为白色念珠菌感染，感染率为43%。贾玉萍等［12］研究发现，山东部分地区个体养殖户奶牛奶样的真菌感染阳性率为19.3%，规模化养殖场真菌感染阳性率为7.62%，都明显低于宁夏地区的真菌感染率。畜主长期使用抗生素及糖皮质激素类药物后，大多数细菌被抑制或杀死，但仍有耐药性细菌生存。此外，由于治疗过程中的无菌操作不规范，不洁净的医疗器具上所携带的白色念珠菌感染乳腺组织，形成生物膜后，抗药性可增强10～1 000倍，加剧真菌感染［13－14］。根据调查发现，宁夏周边许多养殖场（户）在临床用药时只依据以往经验，选择广谱抗生素或联合使用抗生素治疗奶牛乳房炎，而不通过药敏试验测试出疗效最佳的药物，从而导致真菌性乳房炎的发病率不断上升，奶牛的淘汰率逐渐升高，形成恶性循环，给养殖场带来巨大的经济损失。此外，本研究发现白色念珠菌分离株的溶血性弱于人源标准株，分离株磷脂酶活性与标准株接近。但分离株的溶血性和磷脂酶活性都要弱于口腔来源的人源分离株，提示人源的病原菌传播速度更快，临床上更普遍，人源白色念珠菌致病性更强［15－18］。

药敏试验结果表明，AMB、TER等抗真菌药物对分离株杀菌效果极好，但常见的抗生素几乎无效，这与张园［19］研究结果一致。目前，兽医临床上还没有专用的乳房灌注类抗真菌药物，只能使用抗生素和中药。本研究发现中药双黄连对分离株的杀菌效果明显。有研究证实许多具有杀菌抗炎、抗氧化、调节免疫等作用的中药确有疗效，且毒性低、无抗药性和药物残留［20］。同时，中药的使用也可避免耐药菌的出现，防止超级细菌通过乳汁感染人。另外，也避免了牛奶中残留的抗生素引发人体超敏反应的可能［21］。有研究表明，中草药制剂不仅对隐性乳房炎有较好的疗效，还能在一定程度上提高产奶量［22］。因此，快速准确地诊断病原微生物，对减少经济损失、指导临床用药具有重要意义。同时，本研究发现白色念珠菌分离株具有很强的形成生物膜的能力，在治疗奶牛乳房炎时，严格按照要求对医疗器械消毒，注意无菌操作显得尤为重要。在饲养过程中加强预防措施，如定期进行乳房炎检测、淘汰慢性乳房炎奶牛、加强挤奶卫生管理等［23］。

4 结 论

本试验通过研究23份抗生素治疗无效病牛奶样，发现白色念珠菌感染率为43%。白色念珠菌分离株的溶血性、磷脂酶活性和成膜能力都较强，分离株只对中药和抗真菌药物敏感。因此，在治疗奶牛乳房炎的过程中建议先查清楚病原，并尽量选取合适的中药，避免盲目使用抗生素治疗。

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（责任编辑 董晓云）

中图分类号：S858.23

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3356－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.040

收稿日期：2016－05－16

基金项目：国家自然科学基金项目（31660728）

作者简介：何 芳（1991－），女，江苏连云港人，硕士生，研究方向：兽医药理学，E－mail：837800131＠qq.com

通信作者：＊周学章（1969－），男，宁夏银川人，博士，教授，硕士生导师，研究方向：兽医药理学，E－mail：zhouxuezhang＠nxu.edu.cn

Isolation，Identification and Analysis of Biological Characteristics ofCandidaalbicansin Bouine Mastitis

HE Fang1，LU Jin－xia1，FENG Feng1，ZHOU Xue－zhang1，2＊
（1.KeyLaboratoryofMinistryofEducationforProtectionandUtilizationofSpecial BiologicalResourcesinWesternChina，NingxiaUniversity，Yinchuan750021，China；2.NingxiaZoohanceBiotechCo.，Ltd.，Yinchuan750021，China）

Abstract：The study was aimed to learn the infection of dairy cows with fungi in Ningxia and take effective measures to prevent and control the fungi infection.Milk samples were collected from dairy cows that did not respond to antibiotics in Ningxia，fungi in milk samples were separated and identified，and the biological characteristics of isolated bacteria were analyzed.Milk samples infected by fungus were screened out using fungal selective medium.The yeast pathogen was shown to beCandidaalbicansby biochemistry and molecular biology methods.Determination of enzyme activity and biofilm－forming tests confirmed that it had different levels of virulence with strong pathogenicity to experimental animals.Drug sensitive test was carried out by K－B programe，the results showed that the isolates were resistant to clinical commonly used antibiotics，and were sensitive to clinical common antifungal drugs.The fungal mastitis was caused byCandidaalbicansin Ningxia，the ratio of fungal infection was 43%.Candidaalbicanshad strong virulence and were resistant to common antibiotic and sensitivity to antifungal drugs and traditional Chinese medicine.

Key words：Candidaalbicans；mastitis；pathogenicity；haemolysin