顶空固相微萃取在古井贡酒香气分析中的方法优化

2016-02-15刘晴川林佩静黄香绮

安徽师范大学学报（自然科学版） 2016年6期

刘晴川, 陈峰, 刘飞, 林佩静, 黄香绮

(1.合肥工业大学生物与医学工程学院,安徽合肥 230009;2.美国克莱姆森大学农业、森林与生命科学学院,美国克莱姆森 29634;3.淮北师范大学生命科学学院,安徽淮北 235000)

刘晴川1, 陈峰2, 刘飞3, 林佩静2, 黄香绮2

对古井贡酒香气物质顶空固态微萃取的条件即萃取温度、萃取时间和离子浓度进行优化.通过比较香气物质的总萃取量和10种白酒中特征香气化合物的变化特征,得到最优萃取条件为：用饱和食盐水将酒样稀释至酒精度5%v/v,40℃水浴平衡30分钟后,插入萃取头顶空萃取60分钟.此条件下可萃取到67种香气物质,包括酯类38种,醇类9种,醛4种及其他化合物.

古井贡酒;香气;固相微萃取;气相色谱-质谱连用

中国白酒为蒸馏酒,由98%的乙醇-水溶液和2%香气物质组成[1],有酱香型,浓香型,清香型和兼香型四大香型分类[2,3].不同香型白酒有其特有的特征香气物质,如浓香型白酒中的古井贡酒,由己酸乙酯提供浓烈的水果菠萝香,其他香气源自酯,醇,醛,酸,酮等物质[4].香气是白酒风味的保证,研究其组分对白酒质量控制，新产品研发均有重要作用.

顶空固相微萃取(HS-SPME)为集萃取,浓缩和进样三种功能于一身的无溶剂萃取手段.此法高效简便,适用于痕量物质的萃取浓缩,现广泛用于酒的香气分析[5,6].HS-SPME的萃取结果受萃取条件影响[7],溶液的离子浓度升高可降低水分子与香气物质的结合,有利于醇和酸的挥发[8].常用的萃取温度为40-60℃,低温有利于小分子易挥发物质的萃取[9],高温有利于高沸点香气的挥发,过高也会引起部分香气的分解或相互反应[10].在宋河酒的香气萃取优化中酯类数量和醇类总浓度随着温度升高先增后减，酸在高温下萃取量更大[1].在平衡前SPME的萃取量由萃取时间决定[6].合适的萃取时间可兼顾萃取浓度和实验效率[11].古井贡酒的有机香气物质可溶于水或乙醇,香气数量多,香气间浓度,性质差异巨大[9].因此,萃取条件的优化十分必要.本文研究了不同萃取时间,萃取温度,和离子浓度下顶空固相微萃取技术对古井贡酒香气萃取的效率,尝试找出最优的萃取条件.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用古井贡酒为“26年原浆酒”，酒精度50%v/v，购于安徽亳州古井贡酒厂;固相微萃取手柄,100μmPDMS萃取头,5.0mL玻璃样品瓶及配套瓶盖和聚四氟乙烯硅胶密封垫(Supelco,USA);ACS标准丙酮(优级纯)和205型恒温水浴锅(FisherScientific,USA);直链烷烃标准品(C8-C20)和氯化钠 (纯度>99.5%)购自美国Sigma-Aldrich公司;以及Millipore净水系统(Millipore,USA).

1.2 主要仪器设备

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS):ShimadzuGC-17A-QP5050Amassspectrometerdetector(MSD).DB-5型号毛细管色谱柱(60m×0.26mm×0.25μm)购自美国Agilent公司.

1.2.1 气相色谱设定气相色谱仪升温程序由预实验得出.载气为高纯氦气(99.999%),载气流速1.0mL/min.进样口安装0.75mmRestek衬管,DB-5毛细管色谱柱.进样口温度250℃,不分流模式进样.升温程序:

初始35°C保持5min; 5°C/min升至80°C保持5min;然后1°C/min升至115°C保持3min;再以4℃/min升至160℃保持1min;最后20℃/min升到300℃保持5min.

1.2.2 质谱设定质谱采用四级杆质量选择器,EI离子源,离子源电离电压70eV,温度250℃,扫描以0.3s为间隔,扫描时间1-81min,扫描离子碎片质量范围40-350m/z.

1.3 物质定性分析

挥发性香气成分由下面两种方法共同定性.

(1)将质谱图与NIST 08数据库,Shimadzu Terpene and Terpenoid数据库,以及Wiley 7数据库进行比对,要求相似度达90%以上.

(2)计算各香气物质的Kovats指数(KRI),与文献对比后定性;碳链数小于7的化合物由质谱图定性.

KRI值计算公式如下:

(1)

其中：Tz

1.4 顶空固相微萃取

白酒用饱和氯化钠溶液稀释至酒精度5%v/v,将2.7mL稀释后样品加入5.0mL玻璃样品瓶中,立即盖紧,放入40℃水浴中平衡30min,之后将高温活化(250℃活化1h)的PDMS萃取头插入样品瓶顶空,使其悬于液面上方1mm,萃取60min.之后立即将萃取头插入气相色谱进样口,热解析3min,解吸同时气相色谱开始运行.热解析完成后萃取头继续在进样口烘烤10min.每个样品平行测定3次.

1.5 统计分析

实验结果使用JMP(John’sMacintoshProgram)软件,采用了ANOVA,Tukey’sWtest以及pairedt-test三种统计方法进行分析,所有统计方法的置信区间为α=0.05.

2 结果与分析

由GC-MS分离鉴定的香气物质总离子色谱图TIC(扣除乙醇峰面积)和选定特征香气物质的峰面积,通过比较香气物质萃取的数量,香气物质总响应值/峰面积,以及特征香气物质峰面积的变化,讨论样品离子浓度、萃取温度和萃取时间对萃取结果的影响.此次共鉴定出67种香气物质,古井贡酒的特征香气己酸乙酯占总香气物质含量的77% (表1).然而,其浓度过高会导致分析偏差,且单一化合物不能代表其他结构香气物质的变化,故选取除己酸乙酯外的其他化合物进行萃取条件优化分析.

2.1 离子浓度

图1 离子浓度对萃取总量的影响Fig.1 Total detector’s responses of all volatiles under different sodium chloride concentrations

盐类与水分子结合,降低挥发性化合物的溶解度,同时改变液-气界面的性质,推动香气物质离开液相进入顶空[8, 14].本实验选择氯化钠增加样品的离子浓度,基于其广泛而廉价的来源,及不同温度下溶解度的稳定性.

小分子挥发性物质,尤其是醇类,在纯水溶液中溶解度大,难以萃取.在纯水稀释组只萃取到了17种挥发性香气,包括2种醛类和2种醇类.饱和氯化钠组萃取到32种香气物质,醇7种,醛3种,酮1种, 1种芳香族化合物,以及多种酯类.纯水组的总萃取量是加盐组的60.72%(图1).同时,半挥发性香气的萃取量在加盐后显著上升,同种物质峰面积增加,表明离子浓度升高促进了香气物质的挥发.因此,在顶空固相微萃取的样品处理中应使用饱和氯化钠溶液进行稀释.

2.2 萃取温度

萃取温度决定挥发性物质在萃取头,顶空和溶液三相的浓度分布,直接影响萃取的效果[15].本实验选择25,40,50℃三个温度进行测定[5,16,17].将白酒用饱和食盐水稀释至5%v/v后40℃水浴平衡30min,萃取60min后进样.通过比较不同温度下萃取得到香气物质的数量、香气物质的总响应值以及选定的特征香气物质的峰面积变化来讨论最优萃取温度.

表1 最优条件下萃取到的所有香气物质

a实验萃取得到的所有香气物质根据其种类排列;b 实验测得香气物质KRI值;c 香气物质仅依靠GC-MS定性;d 香气物质平均峰面积的百分比;e 平均峰面积百分比的标准偏差

aCompounds were sorted by chemical functional groups and identified by comparing GC-MS database and Kovats Retention Index (KRI);bExperimental Kovats Retention Index was based on DB-5 MS capillary columncCompound was tentatively identified based on comparing mass spectrum with GC-MS database onlydAverage peak area percentage of each compound from triplicate experiment; eStandard deviation of average area%

在25℃时鉴定到55种香气;40℃时萃取到67种香气物质,其中酯类38种,醇类9种,醛4种;50℃共鉴定出香气50种(表2).三组温度下均存在的香气47种.40℃时香气萃取数量最多,酯和醇的数量也优于其他两个温度. 除了香气数量和总响应值的分析,以十种特征性挥发性物质:乙酸乙酯,丁酸乙酯,戊酸乙酯,庚酸乙酯,辛酸乙酯,3-苯丙酸乙酯,1-己醇,2-壬酮,3-甲基丁醛和己酸酐作为代表,用于分析不同化学结构的香气物质受萃取温度的影响.其选取标准为香气种类、数量和浓度在酒中的占比以及在色谱图中的分布.

香气总峰面积随着温度升高而增加(图2).故高温有利于香气的挥发和萃取.温度由25℃升至50℃时,总峰面积显著增加.相邻两温度间的响应值没有明显增长.在25℃时香气总响应值最低;低温无法使多数挥发性物质有效突破溶液-顶空的界限[18],导致挥发性物质如2-戊酮和2-戊醇无法检出(表1).故此,25℃不适合香气萃取.40℃的总峰面积不是最高,但与50℃的结果比没有显著差异.在47种共有香气中,有32种香气的响应值在40℃达到最大.故40℃的条件能兼顾香气萃取数量和萃取浓度.温度的适当升高促进香气物质挥发,同时避免温度过高导致的再次解吸.50℃时香气数量减少,总

表2 三种萃取温度下鉴定得到的香气物质种类及数量

图2 不同萃取温度下萃取总量的变化Fig.2 Total detector’s responses of all volatiles under different SPME extraction temperatures

峰面积最大,47种香气中有15种达到其最大响应值.高温加速了分子运动速率,在增加顶空中香气物质浓度的同时也降低了萃取头对易挥发香气的吸附力[19].Saison et al报道了高温会降低挥发性物质在萃取头和顶空间的分布系数,从而造成的高温下多种挥发性物质萃取量的降低[20].Pawliszyn and Lord在使用PDMS萃取甲基苯丙胺的时有类似结果[11].

酯类化合物中,乙酸乙酯和辛酸乙酯在50℃萃取量最大,但其萃取量在40℃和50℃时没有差异.其余四种酯类均在40℃有最大萃取量,之后随温度升高萃取量减少(图3).Rodríguez-Bencomo et al报道了类似的香气物质在高温状态下萃取量降低的现象[17].

非酯类物质均呈现先升高后下降的趋势(图4),在40℃有最大萃取量，1-己醇和2-壬酮在50℃时萃取量显著降低.综上所述,酯类和其他香气物质在40℃时有最佳萃取量, 升高温度结果没有明显优化,反而会抑制萃取.故40℃为最佳萃取温度.

图3 萃取温度对六种特征酯类化合物萃取效率的影响

*因3-苯丙酸乙酯实际萃取浓度过低,图中3-苯丙酸乙酯显示的萃取量放大了10倍用于比较

Fig.3 Influence of the extraction temperature on the extraction efficiency of selected ester compounds

* Peak area of ethylphenyl propanpate was 10 times larger in the Fig. to match the scale of others

图4 萃取温度对四种非酯类化合物萃取效率的影响

Fig.4 Influence of the extraction temperature on the extraction efficiency of selected compounds

2.3 萃取时间

萃取时间是另一影响因素.长时间萃取耗时,可以让香气物质在三相间达到平衡;时间过短则无法有效

萃取半挥发性物质.选取四个萃取时间(10min,30min,60min和90min)进行优化.香气物质数量在60min组最多,有67种,90min组最少仅有56种(表3).

香气总峰面积随着萃取时间增加而显著提高,长时间萃取使更多香气挥发至顶空并在萃取头上达到平衡(图5).当时间从30min增长到60min时,总峰面积显著增加,延长至90min时没有显著变化.60min组萃取到最多的香气物质,有合适的总响应值,因此60min是合适的萃取时间.

表3 不同萃取时间下香气物质数量变化

图5 不同萃取时间下香气物质萃取总量的变化

Fig.5 Total detector’s responses of all volatiles under different SPME extraction times

图6 不同萃取时间下酯类化合物萃取量的变化

*3-苯丙酸乙酯图示浓度为实际浓度的10倍

Fig.6 Influence of the extraction time on the extraction efficiency of selected ester compounds

*: Peak area of ethylphenyl propanpate was 10 times larger in the figure to match the scale of others

图7 非酯类化合物在不同萃取时间下的萃取量变化Fig.7 Influence of the extraction time on the extraction efficiency of selected compounds

乙酸乙酯作为最短碳链的酯类,不同时长的萃取量没有显著差异,在60min时达到最大(图6).其他的长链酯类的萃取量随着萃取时间的增加而增大,在90min时达到最大.丁酸乙酯,戊酸乙酯和庚酸乙酯在萃取时间从30min增加到60min时萃取量显著增长.3-苯丙酸乙酯是唯一随着时间增加而萃取量显著增加的酯类,其余酯类在60min和90min的萃取量没有明显差异.因其在白酒中的低浓度,大分子量和不易挥发的特性,需要更长的平衡时间.

非酯类化合物中, 小分子3-甲基丁醛的变化与乙酸乙酯类似,且在60min达到峰值.1-己醇在不同萃取时间下萃取量波动较大,呈先降低后升高再降低的模式,同样在60min有最大萃取量.己酸酐和2-壬酮的萃取量则随着时间的延长而增加(图7).

短链酯类在长时间的萃取过程中萃取量减少,而长链酯类的萃取量随着时间的延长而增加[16,21].易挥发香气可以短时间内在不同介质间达到平衡,故对萃取时间的变化不敏感;而挥发性弱的香气物质则需要较长时间达到平衡,从而在长时间的萃取后才有理想的结果[22].过长的萃取时间在降低效率的同时易造成部分香气物质的过量,进而影响分离鉴定.白酒中香气多为小分子易挥发物质,结合萃取总量以及单一物质的最优萃取时间,认为60min的可以兼顾萃取浓度,时间效率和稳定性,为最优萃取时间.

3 结论

通过对顶空固相微萃取的样品离子浓度,萃取温度,和萃取时间的讨论,古井贡酒的香气最佳萃取条件为:白酒样品用饱和氯化钠溶液稀释至酒精度5%v/v,在40水浴下平衡30min后PDMS萃取头萃取60min.此条件在兼顾了实验效率的情况下,可以萃取到67种香气物质,数量和种类最多,保证香气鉴定的完整性.其中32种香气物质有着最高响应值,15种有次高响应值,保证香气鉴定分离的准确性.

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Analyses of Volatile Compounds in Chinese Liquor-Gujing Under Optimized Headspace Solid-Phase Microextraction (HS-SPME)

LIU Qing-chuan1, CHEN Feng2, LIU Fei3, LIN Pei-ching2, HUANG Xiang-qi2

(1. School of Biological and Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. College of Agriculture, Forestry and Life Sciences, Clemson University, Clemson 29634, United States of America; 3. College of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

This research was to find the optimized liquor volatile extraction condition by testing the extraction temperature, extraction time, and ion strength. Based on the total ion chromatogram and ten characteristic volatiles in Gujing liquor, it was found that the optimized extraction condition was diluted the liquor to 5% v/v alcohol content by saturated solution of sodium chloride, and then did a 60 minutes of extraction after 30 minutes equilibrium in 40℃ water bath. Total 67 volatile compounds were extracted under optimized method, including 38 esters, 9 alcohols, 4 aldehydes and some other compounds.

Chinese liquor-Gujing; Flavor; SPME; GC-MS

10.14182/J.cnki.1001-2443.2016.06.010

2016-07-06

国家自然科学基金项目(41371444).

刘晴川(1990-),女,安徽砀山人，助理实验师，硕士.

刘晴川，陈峰，刘飞，等.顶空固相微萃取在古井贡酒香气分析中的方法优化[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2016，39(6)：555-560.

TS207.3;TS

1001-2443(2016)06-0555-06