4种药用植物内生放线菌的分离与初步研究

丁朋晓曾庆华罗 森李小琴王玲红

1.遵义医药高等专科学校，贵州遵义 563006；2.遵义师范学院，贵州遵义 563006

4种药用植物内生放线菌的分离与初步研究

丁朋晓1曾庆华1罗 森1李小琴2王玲红2

1.遵义医药高等专科学校，贵州遵义 563006；2.遵义师范学院，贵州遵义 563006

目的分离并研究具有抑菌活性的药用植物内生放线菌。方法使用高氏一号培养基定向筛选药用植物内生放线菌，采用滤纸扩散法评价分离菌株的抑菌活性，进而通过形态学、生理生化等特征的分析对其进行鉴定。结果共分离得到63株内生放线菌。对金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等表现出选择性抑菌作用的菌株有17株，其中Y6菌株抗菌谱较广、抑菌作用较强。初步鉴定结果表明Y6菌株是链霉菌属的一个成员。结论Y6对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好。

内生放线菌；抑菌活性；分离；鉴定

植物内生菌是指寄生在正常植物组织内部，对植物不会引起明显感染症状的微生物，主要包括真菌、细菌、放线菌。由于内生菌对植物生长不产生明显的影响，所以对内生菌的研究容易被人忽视，人们最早研究内生菌是19世纪中叶开始[1-2]，20世纪90年代以后，内生菌的研究由内生真菌逐渐扩大到内生细菌、内生放线菌。特别是1993年，有学者从短叶紫衫中分离出能够产紫杉醇的内生真菌后，内生菌的研究越来越被人重视[3]，有更多的学者从植物中分离出内生放线菌，有些对植物病原菌有较好的拮抗作用，有些对人体病原菌有较好的拮抗作用[4-6]，内生放线菌成为新的有生物活性的次生代谢产物的重要来源。资料表明，从植物内生菌中得到的活性物质有一半是未知的新化合物，而从土壤微生物中得到的新化合物只占其总量的38%[3]。所以，随着土壤放线菌的大量研究，很难再发现新的生物活性物质。内生菌特殊的生存环境决定了它与外界自然环境中生长的微生物有不同的特性，故植物内生放线菌的研究成为热点。贵州有得天独厚的地理气候条件，药用植物资源丰富，本文采集贵州多种药用植物，对分离到的内生放线菌进行初步鉴定及抗菌活性研究，旨在为药用植物资源的利用开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 用于实验的植物样品鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）、麦冬（Ophiopogon japonicus）、马齿苋（Portulaca deracea L.）、车前草（Plantago depressa Willd.）采自于贵州遵义、铜仁等地，装入无菌袋中4℃保存备用。

1.1.2 培养基 放线菌的分离和筛选采用高氏一号培养基[7]：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，KNO31g，K2HPO40.5g，K2Cr2O70.05mg，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。配置时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次加入其它成分，溶化后补足水分到所需量，调PH值，灭菌。

液体发酵培养基采用酵母膏-麦芽汁培养基：酵母粉4g，麦芽浸提物5g，葡萄糖4g，水1000mL，pH 7.2～7.4[8]。

供试菌株的活化用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.6。

1.1.3 供试菌株 革兰阳性菌：金黄色葡萄 菌（Staphylococcus aureus）、表 皮 葡 萄 球 菌（Staphylococcus epidermidis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；革兰阴性菌：大肠杆菌（Escherichia Coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）均由病原微生物实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 植物内生放线菌的分离 将刚灭菌好的高氏一号培养基，待温度降至55℃左右时，按照75.0mg/L重铬酸钾，100.0mg/L制霉菌素，20.0mg/L萘啶酮酸加入此培养基，用以抑制杂菌生长，充分摇动混匀后将培养基倾注到无菌培养皿内，20W紫外灯照射30min后放置4℃备用[9]。

取采摘的新鲜植物先用清水冲洗去表面泥沙，再用加有洗涤剂的水浸洗15min，清洗过程中尽量不弄伤叶片，待植物稍干后取其根、茎、叶分别剪成1cm的小段，各称重5g，在75%酒精溶液里浸泡5min，无菌水冲洗5次，0.1%升汞溶液浸泡根、茎、叶三个部位都设置不同的侵泡时间2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0min，最后无菌水冲洗4～5次，晾干。将其分别置于无菌研钵中，加入10mL无菌水研碎成汁液，静置15min。将根、茎、叶汁液分别取100μL悬液涂于高氏一号平板培养基内，28℃培养箱中培养1～3周，观察培养基上菌落生长情况。生长出的菌株用平板划线分离法进一步纯化菌落，挑取肉眼观察形态有差异的菌落进行纯培养，4℃保存备用。

1.2.2 植物表面消毒的检测 采用漂洗液检验法，取最后一次的洗涤水300μL涂布在高氏一号培养基上。每个样品重复3次，于28℃，培养1～4周，若培养基上均无菌落出现，表明植物材料表面消毒彻底[10]。

1.2.3 供试菌株稀释度的确定 将供试菌株用接种环取一环放到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，培养1d。取1mL放入装有9mL无菌水的试管中配成浓度为10-1的细菌悬浮液，依次配出浓度梯度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的细菌悬浮液，吸取10-3、10-4、10-5和10-6菌悬液100μL分别涂布到牛肉膏蛋白胨培养基上，每个浓度3个重复，置于30℃培养箱，培养24h后观察平板上细菌生长情况，选择长出的菌落刚好覆盖平板时的浓度进行抑菌试验。

1.2.4 内生放线菌抑菌活性检测 用接种环取少量分离纯化到的放线菌接种于含30mL液体发酵培养基的150mL三角瓶中，置于28℃，180r/min摇床上振荡培养7～14d，培养液经4000r/min，4℃离心15min，上清液置4℃冰箱备用。取上述适宜稀释度的菌悬液100μL加入到50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基中混匀，待培养基凝固后，采用滤纸扩散法[11]检测所分离放线菌对供试菌株的拮抗作用，滤纸蘸取无菌水作为空白对照。置于37℃培养箱，24h后观察结果，发酵液活性高的会抑制细菌的生长形成抑菌圈，测量直径大小。每个样品做3个重复。

1.2.5 内生拮抗放线菌的初步鉴定 将具拮抗作用的内生放线菌筛选出来，用划线法接种到高氏一号培养基上，在无菌条件下将灭菌的盖玻片以45°角扦插在接种线上，每个平板扦插4～5片，28℃下培养10d左右，有放线菌的一面朝上，将盖玻片置于显微镜下，观察放线菌、基内菌丝、气生菌丝、孢子丝链特征和生理生化特征进行初步鉴定[12]。

2 结果

2.1 表面消毒效果检测

植株不同部位要想达到彻底消毒效果，所需要的时间略微有差异，根部彻底消毒需要的时间比叶、茎稍长。不同植物所需时间也略有差异，鱼腥草、麦冬≥5min，马齿苋≥5.5min，车前草≥4.5min时，基本无杂菌生长，见表1，但是考虑到一方面消毒时间久可能会同时杀死内生菌，影响内生放线菌的分离；另一方面，为了方便实验操作，所以4种植物最佳消毒时间定为5.5min。

2.2 内生放线菌的分离

对从贵州不同地区采集到的鱼腥草、马齿苋、车前草、麦冬4种植物根、茎、叶通过表面消毒检测，将最后一次洗涤液涂布培养基上无菌落长出，从而证明分离到的菌株是来源于植物内部。4种植物共得到了63株内生放线菌，其中鱼腥草21株、马齿苋23株、车前草12株、麦冬7株。植物不同部位内生放线菌的分布有差异，从根部共分离到32株，占得到放线菌总数的50.79%；从茎中共分离到24株，占38.10%；从叶中共分离到7株，占11.11%。植物不同组织部位分离到的菌株数量由多到少依次是：根＞茎＞叶。见表2。

表1 植物表面消毒结果

表3 4种药用植物内生放线菌对5种供试菌有抑菌活性的菌株数

表2 植物内生放线菌分离的菌株数

2.3 内生放线菌的抗菌活性

采用滤纸扩散法测定分离到的内生放线菌对供试菌的抑菌活性，不同植物内生放线菌能对五种供试菌产生抑菌作用的菌株数有差异，见表3。4种药用植物中共分离到内生放线菌63株，对供试菌有不同程度抑菌活性的菌株有17株，约占分离菌株总数的27.98%。其中8株对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，2株对表皮葡萄球菌有抑菌作用，3株对枯草芽孢杆菌有抑菌作用，7株对大肠杆菌有抑菌作用，1株对铜绿假单胞菌有抑菌作用，见表4。

Y6、C4、C12抑菌普相对较广，其他菌株对供试菌有选择性的抑菌作用。其中Y6表现出较好的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在11mm～16mm，对大肠杆菌的抑菌圈直径在9mm～12mm，其余16株菌株对供试菌产生的抑菌圈直径小于10mm。

表4 对5种供试菌有抑菌活性的菌株统计

2.4 有抑菌活性菌株的初步鉴定

2.4.1 形态特征观察 在抗菌活性检测的基础上，选择抑菌范围广，抑菌圈直径较大的Y6菌株进行初步鉴定研究。将Y6菌株培养在高氏一号培养基上菌落呈圆形，较规则，早期菌落浅灰色，随着培养时间延长菌落颜色加深，通过光学显微镜观察基内菌丝浅褐色、褐色，气生菌丝发达，浅黄色或白色，菌丝比较丰富，孢子链直或偶有螺旋，见图1～2。

图1 Y6生长在高氏一号培养基上形态（10×40）

图2 Y6生长在高氏一号培养基上形态（10×100）

2.4.2 生理生化特征 Y6在对C源的利用上，能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖，但不能利用半乳糖、木糖、肌醇；能够液化明胶，使牛奶先凝固后液化，可以水解淀粉，能够分解硫化氢，但不能水解纤维素。

通过形态特征和生理生化特征，结合《放线菌的分类和鉴定》初步确定Y6为链霉菌属。

3 讨论

植物内生放线菌分离时，消毒处理中设置时间梯度，既保证彻底杀死植物外表面杂菌，又保证分离到更多内生菌，故最后一步用0.1%升汞对根、茎、叶进行不同时间消毒，消毒时间越长，长出杂菌的几率越小，消毒越彻底。不同植物不同组织设置了不同的消毒时间，最终找到每种植物组织的最佳消毒时间，提高内生菌分离概率。本研究以药用植物的根、茎、叶组织为材料，从4种植物中共得到了63株内生放线菌，不仅根部分离到的内生菌数量最多，而且根部彻底消毒需要的时间比叶、茎稍长，除了与植物各器官组织结构和生理代谢不同外，也可能是与根部生长在有机质丰富的土壤中有关[13]，导致根部微生物种类数量比茎、叶多有关。

抗菌活性检测中，分离到的内生放线菌中有17株对供试菌有选择性的抑菌作用。鱼腥草分离到抑菌活性菌株相对较多，主要集中在对革兰阳性菌的抑菌作用。Conn曾报道，植物内生放线菌与植物抗性存在着一定的关联[14]，而鱼腥草含鱼腥草素，对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等多种革兰阳性菌均有不同程度的抑制作用[15]，所以怀疑鱼腥草内生放线菌的抑菌特点与鱼腥草的中药特性有相关性。17株活性菌株中，对2种以上供试菌有选择性抑菌活性的内生放线菌有3株，其中鱼腥草内生放线菌Y6抑菌活性相对较强，具有潜在的研究意义。通过抗菌活性检测，其发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，这对深入开发药用植物资源提供了参考，但是菌株发酵液的抗菌成分的鉴定与分离有待下一步研究。通过高氏一号培养基上生长特征观察、生理生化反应观察，初步确定Y6为链霉菌属。

植物内生放线菌来源特殊，该领域下的内生放线菌的研究还是一个比较欠缺的领域[16]。目前，虽然人们开始越来越多的研究植物内生放线菌，但是主要应用在生防制剂上[17]，故植物内生放线菌还有很大的研究潜力与研究广度。本研究中虽然筛选到了63株对供试菌有选择性抑菌作用的菌株，最终却只有1株相对具有较好的抑菌效果，说明本实验的研究方法还有待进一步改进，以提高有效菌株的分离率。

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Separation of four kinds of medicinal plant endophytic actinomycetes

DING Pengxiao1ZENG Qinghua1LUO Sen1LI Xiaoqin2WANG Linghong2
1.Zunyi Medical College,Zunyi 563006,China;2.Zunyi Normal College,Zunyi 563006,China

ObjectiveTo separate and explore the endophytic actinomycetes of medicinal plants with antibacterial activity.MethodsGao 1 medium was used to directly selected the medicinal plant endophytic actinomycetes. Filter paper diffusion method was used to evaluate the antimicrobial activity of isolated strains.It was identified by morphological, physiological and biochemical characteristics.ResultsA total of 63 strains of endophytic actinomycetes were isolated.There were 17 strains with selective antibacterial activity on staphylococcus aureus,staphylococcus epidermidis,bacillus subtilis,escherichia coli,pseudomonas aeruginosa etc.Among them, the antibacterial spectrum of Y6 strain was broad,and it had strong antibacterial effect. Preliminary identification showed that the Y6 strain was a member of the genus Streptomyces.ConclusionThe inhibitory effect of Y6 on Staphylococcus aureus is better.

Endophytic actinomycetes bacteria;Bacteriostatic activity;Separation;Appraisal

S567

B

2095-0616（2016）21-63-05

2016-08-06）

贵州省遵义市科技计划项目[遵市科合社字（2012）31号]。