盐知母化学成分α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

高 雁 张 爽 宋泽璧 高 慧

辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600

盐知母化学成分α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

高 雁 张 爽 宋泽璧 高 慧▲

辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600

目的对盐知母化学成分α-葡萄糖苷酶抑制作用进行比较研究，以探讨盐知母降血糖作用的增效原理，为后期研发提供科学依据。方法采用高效液相色谱法，以PNPG（对硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷）为底物比较盐知母化学成分对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果从盐知母氯仿层中分离得到的顺-扁柏树脂酚，对α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，且优于阿卡波糖的作用。同时芒果苷、知母皂苷AⅢ等盐知母的增量成分对α-葡萄糖苷酶抑制作用也相对较强。结论盐知母活性部位氯仿层分离物，顺-扁柏树脂酚对α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制活性，提示盐知母活性部位分离物顺-扁柏树脂酚在抗糖尿病产品开发方面具有很好的应用前景。

盐知母；化学成分；α-葡萄糖苷酶；糖尿病

中药知母的来源为百合科植物知母（Anemarrhenaasphode-loidesBge）的干燥根茎，传统功效为清热泻火、滋阴润燥[1]。盐炙法是知母的主要炮制方法，盐知母为历版中国药典所收载，是知母的主流炮制品种。知母盐炙后能够符合“用盐走肾脏”的传统炮制理论，能够引药入肾经，滋阴降火的作用得到增强。本课题组在前期研究盐知母的药效作用时，报道过知母能够降低高血糖大鼠的血糖，且盐知母作用更为显著[2-3]，并对盐知母进行化学成分研究，发现盐炙后知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷含量升高。对盐知母活性部位进行化学成分研究[4]，分离得到顺-扁柏树脂酚、构树宁B、牡荆素[5]。

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的代谢紊乱性疾病。血糖主要来源于食物中的糖类和碳水化合物，其在α-葡萄糖苷酶的作用下被催化水解成单糖，可被小肠吸收。由此可见，α-葡萄糖苷酶是血糖产生的关键酶，有效抑制其作用，可减缓糖尿病患者餐后血糖值[6-8]。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂已广泛应用于临床。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过可逆地占据α-葡萄糖苷酶与碳水化合物的结合位点，抑制α-葡萄糖苷酶水解多糖为单糖，从而有效抑制糖尿病患者的餐后血糖升高[9-10]，使患者血糖维持在一定水平，改善血糖稳定指数。

本实验以盐知母降血糖活性部位氯仿层分离得到的化合物，顺-扁柏树脂酚、构树宁B，以及前期分离得到的增量成分知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和现有的芒果苷、新芒果苷、异芒果苷、牡荆素、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E等化学成分从α-葡萄糖苷酶抑制角度，开展体外降血糖比较研究。以期从中寻找新的α-葡萄糖苷酶抑制剂。研究结果将对阐明盐知母降血糖增效原理提供科学内涵，为今后盐知母临床用药提供指导。

1 仪器与方法

1.1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，Agilent 1100型）；PH酸度计（上海鹏顺科学仪器有限公司）；十万分之一分析天平（瑞士METTLER，AE240型）；电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）。

知母药材购于西陵知母道地产区（河北省易县），经对照药典鉴定为知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎；盐知母按前期优选的工艺自行炮制。芒果苷对照品（批号111607-200402），购自中国食品药品检定研究院，纯度≥98%；新芒果苷对照品（批号20131214）、异芒果苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：20121221）；知母皂苷AⅢ（批号13042609）、知母皂苷BⅡ（批号13120910）、知母皂苷BⅢ（批号13121110）、知母皂苷E（批号13090301）购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度≥98%；顺-扁柏树脂酚、构树宁B，自制，纯度≥98%；牡荆素，自制，纯度≥98%；阿卡波糖（拜耳医药保健有限公司，批号：BJ09769，）；对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海源叶生物技术有限公司）；对-硝基苯酚、牛血清白蛋白纯度≥95%、α-葡萄糖苷酶均购自sigma公司；HPLC级甲醇（天津科密欧）、HPLC级乙腈（天津科密欧）、娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品溶液制备 精密称取适量的新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、牡荆素、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E、顺-扁柏树脂酚、构树宁B、阿卡波糖的对照品，分别配制成浓度为0.270mg/mL、0.233mg/mL、0.234mg/mL、0.207mg/mL、0.287mg/mL、0.496mg/mL、0.192mg/ mL、0.560mg/mL、0.246mg/mL、0.214mg/mL、0.203mg/mL的样品溶液。

1.2.2 反应溶液的制备 磷酸盐缓冲液（pH6.8）：称取K2HPO4·3H2O、KH2PO4适量（7.6834g、4.5819g），用超纯水溶解，调整pH至6.8，然后定容500mL，置冰箱保藏。

α-葡萄糖苷酶：取α-葡萄糖苷酶，用含0.2% BSA上述磷酸缓冲溶液溶解，配制成α-葡萄糖苷酶储备溶液（0.3U/mL）。

PNPG溶液：精密称取适量 PNPG，用少许缓冲溶液溶解，然后定容于10mL，置冰箱保藏。

Na2CO3终止剂：称取2.162g Na2CO3，用少许超纯水溶解，然后定容于100mL。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定[11-14]取1.5mL离心管中，向其中加入10μL磷酸盐缓冲溶液（pH 6.8）和30μL α-葡萄糖苷酶，振荡混匀，于37℃孵育20min，加入40μL PNPG（8.0mmol/L）开启反应，振荡混匀，于37℃反应30min，之后加入80μL Na2CO3（0.2mol/L）终止反应，再加水稀释，至500μL，振荡混匀，过滤。采用HPLC法，检测产物中PNP的浓度，计算α-葡萄糖苷酶的活性。

取1.2.1中各样品溶液作为待测样品，以相同体积代替缓冲溶液加入到反应体系中。同时设置阳性对照（以等体积的Acarbose代替磷酸盐缓冲溶液）、空白对照（以等体积的磷酸盐缓冲溶液代替酶液），测试各个单体成分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，计算抑制率：抑制率=A-B/A×100%式中，A为不加待测样品时PNP的浓度（扣除相应空白，mmol/L）；B为加入待测样品后PNP的浓度（扣除相应空白，mmol/L）。

1.2.4 HPLC法测定PNP的含量 色谱条件：Ecosil色谱柱（4.6mm×250mm，120-5-C18AQ，5μm），流动相为乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱条件为：0～8min，20%～29%A；8～14min，29%～80%A；14～18 min，80%～20%A；18～28min，20%～20%A；以314nm为检测波长，流速为1.0mL/min，进样量为20 μL，柱温为室温。

PNP标准曲线：精确称取PNP标准品置50mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液超声溶解后，加磷酸盐缓冲溶液至刻度，制备PNP储备液（5.68mmol/L）。将储备液稀释成1.136mmol/L、0.568mmol/L、0.284mmol/L、0.170mmol/L、0.0568mmol/L、0.0284mmol/L、0.0170 mmol/L，按照上述梯度洗脱条件，分别进样，以所得峰面积为纵坐标，以PNP浓度为横坐标，绘制标准曲线。按照上述色谱条件，各待测样品反应溶液分别进样，根据峰面积计算浓度。

2 结果

2.1 PNP标准工作曲线

求得PNP标准曲线的回归方程为y=36057x+459.08，r=0.9993， 说 明 PNP在0.017～1.136mmol/L与峰面积之间呈现的线性关系。

2.2 盐知母化学成分对α-葡萄糖苷酶抑制作用

实验结果显示：各化合物中以从盐知母活性部位中分离得到的顺-扁柏树脂酚对α-葡萄糖苷酶抑制作用最强，且明显优于阿卡波糖的作用。同时芒果苷、知母皂苷AⅢ等盐知母的增量成分对α-葡萄糖苷酶抑制率也相对较高。见表1。

表1 各成分对α-葡萄糖苷酶的抑制率

3 讨论

目前，评价药物降血糖作用的指标主要为血糖以及胰岛素水平。血糖水平评价主要包括体内空腹血糖、糖耐量以及体外酶抑制两方面。本实验采用PNPG为底物的酶抑制剂筛选模型进而评价盐知母化学成分的降血糖作用，该方法快捷、简单易于操作。

合成类药物包括阿卡波糖、伏格列波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂已广泛应用于临床[15]。但由于存在一些副作用。所以，更多的研究着重于从中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，为了寻找到更安全、高效的糖尿病治疗药。本实验对现有的盐知母化学成分进行酶抑制作用研究。实验结果显示，从盐知母降血糖活性部位氯仿层中分离得到的顺-扁柏树脂酚，对α-葡萄糖苷酶抑制作用最强。同时芒果苷、知母皂苷AⅢ等对α-葡萄糖苷酶抑制率也相对较高。这就提示盐知母降血糖作用显著增强可能与盐知母的新增成分及增量成分有关，在以后工作中将进一步予以研究。因此，本实验为研究盐知母化学成分酶抑制剂提供了理论依据，为盐知母作为糖尿病治疗药的进一步开发利用提供了科学参考。

[1]中国药典[S].一部.2015：212-213.

[2] 高慧.盐知母炮制原理研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2010：30-31.

[3] 吴莹，宋泽璧，高慧，等.知母盐制前后降血糖作用及其机制[J].中国医院药学杂志，2014，34（23）：1977-1980.

[4] 吴莹，高慧，宋泽璧.盐知母不同有效部位改善链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠糖代谢的研究[J].现代药物与临床，2016，31（3）：280-283.

[5] 宋泽璧.盐知母降血糖物质基础研究[D].沈阳：辽宁中医药大学，2015：29-31.

[6] 张钟，吴文婷，王萍，等.荔枝水溶性多糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性测定[J].食品科学，2013，34（13）：175-179.

[7] 罗晶洁，王尉，曹学丽.桑叶多糖的分离纯化及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性[J].食品科学，2011，3（32）：112-116.

[8] 于彩云，高兆兰，陈天姿，等.天然产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展[J].食品工业科技，2015，22：394-399.

[9] Vande Laar FA，LucassenPL，AkkermansRP，et al.Alphaglucosidase inhibitors for type2diabetes mellitus[J]. Cochrane Database of Systematic Reviews，2005，18（2）：36-39.

[10] Ashok KT，Ravindra MK，Sachin BA，et al. Reductioninpost-prandial hyperglycemic excursion throughα-glucosidase inhi-bition byβ-acetamido carbonyl compounds[J].Bioorg Med ChemLett，2008，18：4130.

[11] 朱文佳，寇自农，张曦，等.α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选方法的研究[J].食品研究与开发，2012，33（8）：171-175.

[12] 张淑鹏，李琳琳，木合布力·阿布力孜，等.昆仑雪菊提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].现代生物医学进展，2011，6（13）：1055-1058.

[13] 康文艺，张丽，宋艳丽.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中国中药杂志，2009，4（34）：406-409.

[14] 张倩，常星，康文艺.芭蕉的α-葡萄糖苷酶抑制活性[J].食品工艺科技，2010，2（31）：125-130.

[15] 王翼，张旭.α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展[J].海峡药学，2009，21（9）：4-5.

Study on inhibitory effect of chemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma on α-glucosidase

GAO Yan ZHANG Shuang SONG Zebi GAO Hui
School of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China

ObjectiveTo compare the inhibitory effect of chemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma on α-glucosidase, to explore itsthe synergistic effects ofhypoglycemic mechanism, and to provide the scientific basis for later research.MethodsWith the method of HPLC, PNPG was used as substrate to compare the α-glucosidase inhibition effect between the differentchemical componentsin the salt AnemarrhenaeRhizoma.ResultsThe separation from the salt AnemarrhenaeRhizoma by chloroform-cis-hinokiresionl had a strong inhibitory effect onαglucosidase, and it was better than the positive control group acarbose. The incremental compontensin the salt AnemarrhenaeRhizomalike mangiferin and timosaponin AⅢ groups showed a certain inhibition.ConclusionThe extraction of the salt processed AnemarrhenaeRhizoma by chloroform-cis-hinokiresionl can inhibit α-glucosidase activity obviously, which reminds us it has good application prospects in product development of antidiabetics.

SaltAnemarrhenaRhizoma;Chemical components;α-glucosidase;Diabetes

R284

B

2095-0616（2016）21-60-03

2016-08-02）

国家自然科学基金项目（81102810）；辽宁省自然科学基金项目（201320165）。

▲通讯作者