毒热清颗粒提取工艺优选

施钧瀚秦会珍，2Δ郑 弘孟祥乐，2▲

1.河南中医学院第一附属医院，河南郑州 450000；2.河南大学药学院，河南开封 475004

毒热清颗粒提取工艺优选

施钧瀚1秦会珍1，2Δ郑 弘1孟祥乐1，2▲

1.河南中医学院第一附属医院，河南郑州 450000；2.河南大学药学院，河南开封 475004

目的优选毒热清颗粒的水提工艺条件。方法以黄芩苷，绿原酸为指标，HPLC测定含量，Agilent ZORBAX XDB-C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm)，流动相甲醇-0.4%磷酸梯度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长为280nm（黄芩苷）、327nm（绿原酸）。选加水量、提取次数、提取时间为考察因素，采用L9（34）正交试验优选毒热清颗粒的水提取工艺。结果最佳水提取工艺为加12倍量水提取2次，每次2h。结论该工艺有效成分提取完全，工艺简单，适合于工业生产的需要。

毒热清颗粒；黄芩苷；正交试验；高效液相色谱法；提取工艺

毒热清颗粒方是医院临床经验方。该方药具有清热解毒、泻火散结之功效。用于热毒壅盛证，症见壮热口渴，心胸烦热、口舌生疮，瘰疬痰核，疔疮肿毒，小便黄赤等。方中黄芩清热燥湿，泻火解毒；金银花清热解毒，疏散风热，连翘、紫花地丁清热解毒，凉血消肿散结，甘草清热解毒，调和诸药。全方共奏清热解毒、泻火散结之功。本文对该方的提取工艺进行研究，拟制成医院制剂。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪；色谱柱：Agilent XDB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；Sartorius CP225D电子天平，科导台式超声波清洗器（Hk250型），AP-01P型真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；黄芩苷对照品（批号：110715-201318）、绿原酸对照品（批号：110753-201314）均来源于中国食品药品检定研究院，用于流动相试剂均为色谱纯，西格玛公司生产，水为纯化水，其它试剂为分析纯。饮片来源于安徽普仁药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 提取工艺的选择

根据处方中药材的成分参照参照参考文献[1-2]，采用水煎煮提取工艺，用正交试验对提取工艺进行优选。

2.2 正交实验设计

根据文献[3-7]，指标成分选取黄芩苷 、绿原酸，采用L9（34）正交表安排实验，对加水量、提取时间、提取次数进行考察。因素水平表见表1。

2.3 样品制备

称取药材9份（按处方比例），按表 2试验分别提取，合并提取液，冷却（室温）后测量体积，备用。

表1 因素水平表

2.4 含量测定

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品11.92mg，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含238.2μg的对照品溶液。取绿原酸对照品10.54mg，精密称定，加甲醇定容至50mL，制成每1mL含210.8μg的对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 量取正交试验的样品10.0mL甲醇稀释至50mL，摇匀静置，取上清液即得。

2.4.3 阴性对照溶液的制备 缺黄芩样品溶液：称取本处方中的药材（按处方比例不含黄芩），按正交5号的条件制备缺黄芩样品，然后按供试品溶液制备方法制备，得缺黄芩阴性对照溶液。

缺金银花样品溶液：称取本处方中的药材（按处方比例不含金银花），按正交5号的条件制备缺金银花样品，然后按供试品溶液制备方法制备，得缺金银花阴性对照溶液。

2.4.4 色谱条件色谱柱 Agilent XDB-C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相甲醇-0.4%磷酸梯度洗脱：0～25，甲醇25～47，25～35，甲醇47～47，35～36甲醇47～25，36～40甲醇25～25；检测波长为280nm（黄芩苷）和327nm（绿原酸）[8-9]，流速：1.0mL/min，柱温25℃。

2.4.5 专属性试验 取以上各种样品溶液（对照品、供试品、阴性溶液）各5μL，依法测定，记录色谱图，见图1。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同的色谱峰，而阴性溶液在待测组分处无干扰。

图1 HPLC图

2.4.6 标准曲线的绘制 取黄芩苷对照品溶液（每 1mL含 238.2μg）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成5种不同浓度的黄芩苷对照品溶液，取绿原酸对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成5种不同浓度的绿原酸对照品溶液，取上不同浓度的黄芩苷和绿原酸对照品溶液，分别依法测定其峰面积。以对照品峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得黄芩苷回归方程为：Y=3.10E+06X-1.56E+05（R=0.9999）；绿原酸回归方程为：Y=1.28E+06X-5.67E+04（R=0.9999），结果表明黄芩苷进样量在0.4764～2.382 μg，绿原酸在0.4216～2.108μg成线性关系。

表2 正交试验表及结果

表3 方差分析表

2.4.7 重复性试验 重复性试验 取黄芩苷和绿原酸对照品等体积混合溶液，连续测定6次，每次进样5μL，测定峰面积，计算得其黄芩苷RSD为0.6%，绿原酸RSD为0.7%。结果表明，仪器精密度良好。

2.4.8 稳定性试验 取供试品依法测定，于0、2、4、6、8、10、12h各进样1次，测定黄芩苷、绿原酸峰面积，计算得黄芩苷RSD为1.2%，绿原酸RSD为1.1%。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

2.5 工艺优选

工艺优选：以黄芩苷和绿原酸的正交实验提取含量为指标，计算试验结果（黄芩苷和绿原酸的提取量计算方法为：提取量=供试品溶液浓度×稀释倍数×水煎液体积÷投料药材重量），结果见表2～3。

结果分析：以黄芩苷为考察指标，因素A和B有统计学意义（P＜0.05），C因素有统计学意义（P＜0.01）；以绿原酸为考察指标，因素A和B无统计学意义（P＞0.05），C因素有统计学意义（P＜0.01）；另外，从结果中可以看出以黄芩苷和绿原酸为考察指标结果基本一致，因此，根据正交试验直观分析因素A、因素B和因素C均选择水平3。最佳提取工艺为A3B3C3。即加12倍量水，煎煮3次，每次2h。综合生产实际状况，C因素2水平和3水平相差不大，可以考虑选择水平2，即加12倍量水，煎煮2次，每次2h，即正交实验9的提取方法，该方法属于正交实验，可以不用验证。因此可以验证A3B3C3的提取结果，根据结果确定最终提取工艺。

2.6 工艺验证试验

称取3份处方药材，按照加12倍量水，煎煮2次，每次2h的工艺提取，用上述方法测定黄芩苷和绿原酸的提取量。结果，样品中黄芩苷的提取量分别 为：105.7、103.6、108.0mg/g（RSD=2.08%，n=3），样品中绿原酸的提取量分别为：80.2、78.6、81.5mg/g（RSD=1.81%，n=3），均高于正交实验的最高含量，但是与正交9的结果相差不大，因此最佳工艺定为：加12倍量水，煎煮2次，每次2h，并认为该工艺可行。

3 讨论

本实验采用HPLC同时检测黄芩苷、绿原酸的含量，根据文献[9-13]采用甲醇-（0.1%、0.2%、0.4%）磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相，经过实验对比，最终流动相为甲醇-0.4%磷酸梯度洗脱，目标峰达到较好的基线分离，且保留时间适宜。

根据文献提取工艺采用水煎煮提取，以君药黄芩和金银花中黄芩苷、绿原酸的含量为考察指标，文献多采用综合加权评分法[14-15]，但是本实验两种成分的结果相一致，因此对于正交实验结果不再进行综合评分法处理，而是采用分别单独处理。

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Optimization of extraction technology for dureqing granule

SHI Junhan1QIN Huizhen1,2ZHENG Hong1MENG Xiangle1,2
1.First Affiliated Hospital of He'nan University of Traditional Chinese Medicine,He'nan 450000,China; 2.Pharmaceutical College of He'nan University,Kaifeng 475004,China

ObjectiveTo optimize the extraction process of dureqing granule.MethodsBaicalin and chlorogenic acid were used as indexes, HPLC was used to determined content. Agilent ZORBAX XDB-C18colume (4.6mm×150mm,5 μm), Mobile phase methanol -0.4% phosphoric acid gradient elution with flow rate of 1.0 mL/min, UV detection wavelength was 280 nm(baicalin)and 327nm(chlorogenic acid ). Amount of water added, extraction time, and extraction times were selected as the factors. L9（34）orthogonal test was designed to optimize the extraction technology of Dureqing Keli.ResultsOptimal water extraction technology was as follows : adding 12 times amount of water, reflux and extract for 2 h, three times totally.ConclusionThe optimized technology was simple and extract completely, it is applied to industrial manufacture.

Dureqing granule;Bbaicalin;Chlorogenic acid;Orthogonal design;HPLC;Extraction process

R286

B

2095-0616（2016）21-56-04

2016-08-17）

国家自然科学基金·河南省人民政府人才培养联合基金（ U1304824）；中国博士后科学基金特别资助（2015T80772）；中国博士后科学基金面上资助（2015M582190）；河南省博士后基金项目（2014-75）；济源市科技攻关项目(15013034) ；河南省科技厅“三区”人才计划（14104259）。

Δ2016级河南大学在读硕士研究生

▲通讯作者