MMP-9在结直肠癌中的表达及临床意义

金 宁张崇国李红妍王 莉李 娟王科明王朝霞王继荣▲

1.南京医科大学第二附属医院病理科，江苏南京 210011；2.南京医科大学第二附属医院肿瘤科，江苏南京 210011；3.南京医科大学病理教研室，江苏南京 211166

MMP-9在结直肠癌中的表达及临床意义

金 宁1张崇国2李红妍3王 莉2李 娟2王科明2王朝霞2王继荣2▲

1.南京医科大学第二附属医院病理科，江苏南京 210011；2.南京医科大学第二附属医院肿瘤科，江苏南京 210011；3.南京医科大学病理教研室，江苏南京 211166

目的检测基质金属蛋白酶（MMP-9）在结直肠癌中的表达情况，探讨其与肠癌浸润和转移的相关性。方法2007年1月～2010年12月期间在南京医科大学第二附属医院和盐城市第三人民医院就诊的行手术治疗的99例结直肠癌患者作为研究对象。应用组织芯片技术结合免疫组化SP法检测结肠癌组织和自身正常肠黏膜组织中MMP-9的表达情况，分析肠癌的不同病理特征和组织中MMP-9表达之间的关系。结果MMP-9在结直肠癌组织中的表达明显高于正常肠黏膜（P＜0.001）。在浸润深度深、有淋巴结转移、分期晚的患者中，癌组织中MMP-9的表达明显增高（P＜0.05）。癌组织中的表达与患者生存相关，癌组织MMP-9表达高的患者死亡比例高（P＜0.05）。结论MMP-9在结直肠癌组织中的表达和肿瘤浸润深度、淋巴结转移正相关。MMP-9可作为结直肠癌进展的指标，用于判断预后。

结直肠癌；MMP-9；临床意义

在消化道恶性肿瘤中结直肠癌极为常见，近年来，肠癌的发病率和死亡率每年均成上升趋势[1]。目前结直肠癌的有效治疗方法仍是手术治疗，但是术后结直肠癌侵袭转移可导致术后复发甚至死亡。肿瘤的侵袭和转移是导致结直肠癌患者死亡的主要因素[2]。恶性肿瘤浸润、侵袭及复发与转移的机制极其复杂，多种基因／蛋白质的调控，多种细胞因子的参与，多条细胞信号通路的涉及，牵涉到恶性肿瘤细胞的增殖、黏附以及细胞外基质和基膜的降解等不同过程和阶段[3]。基质金属蛋白酶9（MMP-9）是重要的蛋白水解酶，属于基质金属蛋白酶家族（MMPs），起破坏和裂解细胞外基质的作用，从而促发恶性肿瘤细胞浸润和肿瘤相关血管形成，最终促进恶性肿瘤的侵袭、复发和转移[4]。采用免疫组化结合组织芯片技术，本研究检测结直肠癌组织99例和相应的正常肠黏膜组织51例中MMP-9的表达，分析MMP-9的表达与结直肠癌各病理特征间的关系及二者表达的相关性。探讨MMP-9蛋白在结直肠癌侵袭和转移过程中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2007年1月～2010年12月期间在南京医科大学第二附属医院和盐城市第三人民医院行结直肠肠癌切除术的99例病例作为研究对象。患者纳入标准为：行结直肠癌根治术的肿瘤患者；排除标准为：诊断为非结直肠癌的、已经接受结直肠癌切除术、术前接受化疗或放化疗患者。统一在病理科收集肠癌及其对应的正常肠组织蜡块，同时将这些组织制成组织芯片点阵。患者病历中采集数据，包括：姓名、性别、年龄、临床相关指标（血常规、肝肾功能、肿瘤标志等）、病理结果（肿瘤侵犯深度、淋巴结等）等。通过电话、卫生部门及公安户籍询查等途径对结直肠癌患者随访核查，随访终点是死亡，随访的终点时间为2014年5月1日。所有患者都有一份详细的生存和临床调查表，记录患者的一般情况、临床资料和随访情况等。99例患者中男63例，女36例；年龄33～92岁，中位年龄62岁，平均（61.4±12.8）岁。其中有51例患者有相应的正常组织，我们观察癌组织和正常组织中的MMP-9表达情况，并进行相关分析。

1.2 研究方法

1.2.1 组织芯片的制备 复查组织的HE染色切片，对癌和正常组织位点进行标记，每个患者的癌组织和相应正常组织各选3个位点，组织芯间距2.0mm，取样针直径1.0mm，设计10×12点阵，包含120个位点，共制备组织芯片蜡块4个。在52℃恒温烤箱中将组织阵列块加热融合，然后存放4℃冰箱备用。

1.2.2 免疫组化SP法 常规切取厚度约4μm的切片。经过二甲苯脱腊后，再进行水化。切片经3% H2O2酶处理及洗涤后，按照推荐的抗体稀释滴度加入鼠抗人MMP-9单克隆抗体，放置4℃冰箱过夜。接着按顺序滴加羊抗鼠二抗以及辣根过氧化酶-卵白素-生物素标记的复合物，通过DAB显色、苏木素复染，左后封片。使用Olympus DD70 BX51图像采集系统采集组织表达图像， 应用IMAGE-PRO plus4.0图像分析软件分析结果。免疫组化结果判定方法： 每张切片中随机选择10个高倍视野，以背景的染色强度为1，读取吸光值（A）的相对比值，取其均值作为染色强度。

1.2.3 免疫组化评分标准 MMP-9表达的评分依照半定量的IRS方法，由两个病理科医师分别双盲完成。若在双盲读片中量值差异较大，则由两位读片者共同读片，再重新确定分值。染色浓度与染色比例的乘积为MMP-9表达的结果，染色浓度计分方法：0为完全阴性，1为弱阳性，2为中等阳性，3为强阳性；着色细胞比例计分方法：染色细胞比例为全视野的0～25%为1分， 26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。所以，IRS 评分为0～12分。应用受试者工作特征曲线（ROC）分析得出，MMP-9的最优切点值为8。在这些条件下，IRS为≤8被认为是MMP-9低表达，而IRS为＞8则认为是MMP-9高表达。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 结直肠癌组织与正常组织中MMP-9的表达情况

研究队列中，99例癌组织与51例正常组织对比，癌组织中MMP-9表达高于正常组织，表达差异有统计学意义（P＜0.001），见表1。51例有癌旁正常组织的患者进行配比分析，同样看到癌组织中MMP-9表达高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.001），见表2。

表1 MMP-9在癌组织和正常组织中的表达差异

表1 MMP-9在癌组织和正常组织中的表达差异

注：两组数据比较，t=5.0341，P＜0.001

类型 n MMP-9表达癌组织 99 9.25±3.21正常组织 51 6.25±3.89

表2 MMP-9在癌组织和自身正常组织中表达差异

表2 MMP-9在癌组织和自身正常组织中表达差异

注：两组数据比较，t=7.1028，P＜0.001

类型 n MMP-9表达癌组织 51 9.67±3.19正常组织 51 6.25±3.89

2.2 结直肠癌患者MMP-9表达与临床指标、生存预后的关系

99例患者有2例失访，不计入生存分析。相对于癌组织中MMP-9低表达的大肠癌患者的高生存率57.45%，高表达患者的总生存率较低仅36.00%（P＜0.05），见表3。进一步观察癌组织中MMP-9表达与大肠癌患者临床指标间的相关性，结果显示：癌中MMP-9表达高的患者中T4比例高达50.98%，高于MMP-9表达低的患者（P＜0.05）；N1/N2/ N3患者在MMP-9表达高的患者中占60.78%，高于MMP-9表达低的患者中的比例（P＜0.05）；同样远处转移的患者在MMP-9高表达的患者中有29.41%，同样高于MMP-9低表达的患者组（P＜0.05）；TNM分期为Ⅳ期的患者在MMP-9表达高的患者中比例高于低表达组（30.00% vs 6.98%，P＜0.05），提示MMP-9表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期正相关；而与肿瘤病理分级、年龄及性别均无相关性，见表4。同时，我们也发现癌旁组织中的MMP-9表达与任何临床指标均无明显相关，见表5。

表3 结直肠癌组中MMP-9表达与生存的关系[n（%）]

表4 结直肠癌患者中癌组织MMP-9的表达与临床指标间的关系（例，%）

3 讨论

在全球，结直肠癌是第三最常见的肿瘤类型，同时位列致死恶性肿瘤第四位[5]。转移和复发是结直肠癌致死的主要因素，所以高达50%以上的患者确诊时无法接受根治性手术。国内外对结直肠癌复发和转移的机制进行了一系列探索，研究发现了一些与复发转移相关的分子和作用通路，如NOTCH-DAB1-ABL-RHOGEF、KRas、TWIST及MicroRNAs等[6-8]，然而结直肠癌的分子发病和复发转移机制在很大程度上仍然不十分清楚，因此，进一步深入了解结直肠癌复发转移的分子机制，对改善结直肠癌治疗方案及其预后情况都有很大的促进作用。

肿瘤微环境在肿瘤发生中起重要作用，同时参与控制肿瘤的侵袭或转移。肿瘤微环境的组成较为复杂，在支持肿瘤的发展和转移过程中，较多信号因子涉及其中。基质是肿瘤微环境的重要组成，基质降解是促进肿瘤进展的重要关键环节[9-11]。MMPs 是一类具有降解细胞外基质活性的酶家族，酶与锌结合。MMPs 家族的第一种胶原酶在1962 年被发现，到目前为止已近30种。MMP-9在 MMPs中分子量最大，正常情况下以酶原形式分泌，一旦被激活，则形成Ⅳ型胶原酶，一方面通过毛细血管内生、新生血管生成等促进肿瘤的生长及扩散，另外可以破坏和降解邻近肿瘤表面的基底膜和细胞外基质，从而使肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，最终促进肿瘤侵袭和转移[4，11]。研究发现，MMP-9与乳腺癌、骨肉瘤的转移复发相关，在结直肠癌中也有一些零星的报道[12-16]。

表5 结直肠癌患者正常组织中MMP-9的表达与临床指标间的关系[n（%）]

本研究发现，MMP-9 在结直肠癌组织中为强阳性表达，癌组织中的表达为（9.25±3.21），明显高于正常组织水平（6.25±3.89） （P＜0.001）。同时我们发现癌组织中MMP-9表达高的患者中T4比例高达50.98%，高于MMP-9表达低的患者中的比例30.23%（P＜0.05）；有淋巴结转移的患者在MMP-9高表达组别中占60.78%，在MMP-9低表达组占39.53%（P＜0.05）；同时在MMP-9高表达组，29.41%的患者有远处转移，在低表达组远处转移患者比例仅为6.98%。同样MMP-9高表达组，TNM分期中Ⅳ期患者比例明显增高。因此癌组织中MMP-9 的表达水平可判断结直肠癌的浸润进展程度从而帮组确定患者TNM分期。在进一步的研究中我们发现，随访到观察终点时癌组织中MMP-9表达高的患者生存比例低，为36.00%，明显低于MMP-9表达低的患者中的比例57.45%，提示癌组织中MMP-9表达与结直肠癌患者预后相关，MMP-9的高表达会导致患者的预后非常差，这也佐证了MMP-9对于结直肠癌分期的意义是具有临床价值的，是具有连接性的因果关系的，这对结直肠癌患者的临床预后判断具有重要的指导意义。另外，本研究发现MMP-9的表达与肿瘤病理分级、年龄及性别均无相关性，而正常组织中MMP-9的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期均无相关，这证明了MMP-9与结直肠癌细胞的特异性，这对于临床上进一步发现结直肠癌的发病机制，做出合理的临床诊断以及制定针对性的治疗方案具有非常重要的临床价值和意义，同时也为研究针对结直肠癌的靶向药物提供了新的方向。

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Expression of MMP-9 in colorectal carcinoma and its clinical significance

JIN Ning1ZHANG Chongguo2LI Hongyan3WANG Li2LI Juan2WANG Keming2WANG Zhaoxia2WANG Jirong2
1. Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing 210011, China; 2. Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing 210011, China; 3. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Jiangsu, Nanjing 211166, China

ObjectiveTo investigate the expressions of matrix metalloproteinases (MMP-9) in colorectal carcinoma, and to analyze correlation between MMP-9 and invasion and metastasis of colorectal carcinoma.Methods99 cases of colorectal carcinoma patients received radical resection in the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University and Yancheng NO.3 People's Hospital from January 2007 to December 2010 were enrolled in our study. The expressions of MMP-9 in colorectal carcinoma and normal colorectal tissues were detected by using tissue chip technology combined with immunohistochemistry SP assay. The relations between the expressions of MMP-9 and clinicopathological features of colorectal carcinoma were analyzed.ResultsIn colorectal carcinoma, the expression levels of MMP-9 was significantly higher than those of normal colorectal tissues (P＜0.001). Patients with high stage of invasive depth, lymph node metastasis, and high linical stage showed obvious higher positive rates of MMP-9 than those of patients with low stage of invasive depth, without lymph node metastasis, and with low linical stage (P＜0.05). It showed obvious negative correlation among MMP-9 and survival of patients with colorectal carcinoma. Patients with higher MMP-9 expression level in carcinoma tissues showed higher death rates (P＜0.05).ConclusionThe expression of MMP-9 in colorectal carcinoma is closely related to the depth of tumor invasion, lymph node metastasis. MMP-9 can relex the progress of colorectal carcinoma, and judge the prognosis of patients with colorectal carcinoma.

Colorectal carcinoma; MMP-9; Clinical significance

R735.34

A

2095-0616（2016）21-33-05

2016-09-01）

江苏省高校自然科学研究面上项目（15KJB320006）。

▲通讯作者