猪伪狂犬病毒gB基因序列分析

陈如敬，周伦江，吴学敏，黄晓凤,车勇良，严 山，王晨燕，王隆柏，刘玉涛，魏 宏

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)

猪伪狂犬病毒gB基因序列分析

陈如敬，周伦江*，吴学敏，黄晓凤,车勇良，严 山，王晨燕，王隆柏，刘玉涛，魏 宏

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)

2011年以来我国多省免疫猪伪狂犬病毒gE基因缺失苗猪场出现变异型猪伪狂犬病毒(PRV)感染，经典猪伪狂犬病毒疫苗(Bartha-k61)对该病无法提供100%有效保护，已有研究发现变异型PRV和经典PRVgE基因存在特征性变异。为明确变异型PRVgB基因特征，本研究对GenBank中登录的部分PRV代表株gB基因进行分析比较。结果表明，我国经典型和变异型PRV在gB蛋白氨基酸编码区第395位、453位、562位和739位存在特征性差异，但不同来源PRVgB基因的核苷酸和氨基酸同源性分别在98.1%～100%和96.1%～100%。从相互之间的遗传进化关系可以看出，PRV遗传进化出现两个大的遗传分支，呈现明显的地域性。新发变异型和经典型PRV在中国PRV遗传进化分支上呈现各自独立进化小分支；我国近年分离的貉源和约克夏梗犬源与新发变异型PRV则处于同一进化小分支。

猪伪狂犬病毒；gB基因；序列分析

伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科Herpesviridae、α-疱疹病毒亚科Alphaherpesvirinae、水痘病毒属Varicellovirus。伪狂犬病毒能感染多种宿主，并伴有典型的神经症状，常被作为病毒神经生物学研究的理想模型[1-2]。

猪是伪狂犬病毒的天然宿主，感染后主要引起母猪流产死胎、新生仔猪死亡，并伴随有对机体免疫系统的损伤。PRV 基因组全长约150 kb，其基因组 GC含量高达 70.0%以上，共编码100多种蛋白。目前PRV研究主要集中在gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN等[3-4]。gB基因是PRV中较为保守的必需糖蛋白，可促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，并可诱导中和抗体的产生[5-7]。自2011年以来，我国多省市使用gE基因缺失苗(Bartha-k61株)的猪场相继爆发猪伪狂犬疫情，研究发现其和经典PRV存在毒力和抗原性变异。对变异型PRVgE基因进行研究发现，其142～144位存在连续3个碱基(GAC)特征性插入[4,8-11]。但目前对于gB基因特征还未见相关研究，为明确不同类型PRVgB基因特征，本研究通过对GenBank数据库中PRV代表株进行gB基因特征分析，为明确变异型PRVgB基因特征、追溯变异型PRV来源，科学认知和防控PRV提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 毒株来源

本研究通过对NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中登录的PRV分离株进行分析，选取国外野猪和家猪源PRV分离株、疫苗株(Becker株和Bartha株)、我国PRV经典代表株(Ea株)、2011年变异型PRV暴发前分离的PRV毒株(HN-HK株、GX-NL和HYYD-China-2008)与2011年后PRV分离株，以及我国今年分离报道的犬源PRV(BJ/YT株)和貉源PRV(Rang株)的gB基因来进行分析研究。本研究使用的PRV分离株gB基因相关序列信息见表1。

1.2 基因序列分析

1.2.1 核苷酸同源性比较 根据分子生物学分析软件DNAStar对表1中PRV株gB基因核苷酸序列进行核苷酸分析比对，寻找不同类型PRV分离株的特征性变异区。

1.2.2 氨基酸同源性比较 将表1中PRV株gB基因核苷酸序列推导出氨基酸序列，对其进行氨基酸特征性变异区分析比较。

1.2.3 遗传进化分析 利用遗传进化分析软件MEGA，对不同类型的PRV分离株gB基因编码的氨基酸序列进行分析比对后，绘制相互之间的遗传进化树。遗传进化分析时，采用邻近连接法(Neigbor-Joining Methods)，重复计算(Bootstrap)1 000次。

表1 本研究使用的毒株序列信息Table 1 Information on viruses studied

2 结果与分析

2.1 PRV gB基因差异区分析

2.1.1 核苷酸特征 对我国和国外(欧洲源和韩国源)PRV分离株gB基因进行核苷酸序列分析发现：我国PRV在第223～233位存在缺失(AGCCCCGGCCT)，但国外PRV则在第279～281位存在缺失(CGG)；我国和国外(欧洲源和韩国源)PRV在第207～208位、第215～217位、第240～241位、第245位、第247位、第260位、第285～286位、第289位和第306位存在特征地区性差异，结果见图1。

2.1.2 氨基酸特征 从氨基酸序列信息可以看出，我国和国外(欧洲源和韩国源)PRV分离株发现，第72～77位欧洲源和韩国源的PRV 均为PVPGSPGLT(但Becker株和中国株相同)，而中国分离株PRV(不论时间)均为PGTG***AT，此外，还存在多个相对独立的特征性氨基酸变异位点，具体结果见图2。

2.1.3 经典型和变异型中国PRV分离株氨基酸特征 从gB基因编码的氨基酸序列信息可以看出(仅比对有特征性的区域位点)，经典型和变异型中国分离PRV株gB基因在第395位、453位、562位和739位存在差异，结果见表2。

2.2 PRV gB基因序列分析比较

2.2.1 核苷酸同源性比较 从核苷酸同源性可以看出，选取的PRV代表株gB基因核苷酸同源性均较高，在98.1%～100%。欧洲源和韩国源PRV代表株gB基因核苷酸同源性在99.1%以上；中国分离株(经典型和变异型)gB基因核苷酸同源性均在99.6%以上，且与貉源和约克夏梗犬源PRV代表株gB基因核苷酸同源性在99.5%以上，具体见图3。

表2 我国经典型和变异型PRV株氨基酸变异区Table 2 Regions with variations on amino acids in gB genes from typical and variant PRVs

2.2.2 氨基酸同源性比较 从氨基酸同源性可以看出，选取的PRV代表株gB基因编码的氨基酸同源性较高，均在96.1%以上。欧洲源和韩国源的PRV代表株gB基因编码的氨基酸同源性在98.1%以上；中国分离株(经典型和变异型)代表株gB基因编码的氨基酸同源性在99.1%以上，与貉源和约克夏梗犬源PRV代表株gB基因编码的氨基酸同源性也在98.4%以上，具体结果见图4。

2.3 遗传进化分析

利用MEGA绘制PRV不同代表株gB基因编码的氨基酸相关质检的遗传进化关系，从图5可以看出，PRV代表株根据毒株分离来源差异可以分为两个大的分支：国外(欧洲源和韩国源)PRV代表株(▲在前面)处于分支Ⅱ，我国PRV代表株(经典型和变异型)均处于分支Ⅰ。从遗传进化分支Ⅰ可以看出，我国PRV代表株(经典型和变异型)呈现各自独立的遗传进化分支，其中我国PRV经典型代表株(◆在前面)处于Ⅰb分支，变异型PRV都处于Ⅰa分支。此外，我国近年分离的貉源和约克夏梗犬源PRV(★在前面)也处于相同的遗传进化Ⅰa分支。

3 讨论与结论

由于PRV疫苗的广泛使用，世界范围内许多国家的PRV疫情均得到有效控制或根除。但是，自2011年以来，我国多省免疫过猪伪狂犬病毒gE基因缺失苗(Bartha-k61株)的猪群均出现PRV疫情，血清学检测见有PRV gE抗体阳性，且分离的PRV均见有gE基因片段扩增。进行进一步研究发现，经典Bartha疫苗并不能对新发PRV感染提供100%保护，新发PRV表现出毒力变强和抗原性变异[9]。对gE基因分析发现，新发变异型PRV的gE基因在48位和492位存在天冬氨酸的插入[4,8]。本研究通过对PRV相关毒株的gB基因分析发现，变异型PRV和经典型PRV在395位、562位和739位氨基酸存在差异，由于gB基因极为保守，该变异型PRV的生物学功能还有待进一步明确。

通过对PRV不同来源代表株gB基因分析可以看出，PRV在遗传进化上出现明显的地域性，可根据PRV毒株的分离地分为两个大的遗传进化分支：中国分支和国外分支。对PRV中国分支进一步研究发现，PRV近年分离株(变异型PRV)在遗传进化上和经典型PRV分离株在遗传进化上呈现各自独立的遗传进化亚分支。但是，貉源和约克夏梗犬源PRV在遗传进化上也均处于变异型PRV遗传进化亚分支，到底貉源和约克夏梗犬源PRV在本次PRV疫情是否存在某种关联，变异型PRV是否来自其他源动物，还是其他动物源PRV感染来自变异型PRV感染猪群还需要更多的分子流行病学数据分析。

变异型PRV自爆发以来，国内多家单位对针对变异型PRV的疫苗进行大量的研究，通过对变异型PRV的gE/gI/TK多基因缺失苗、gE单基因缺失苗、gE/gI双基因缺失苗等均见有可有效保护变异型PRV对猪群的侵袭[15-20]。但是，究竟是什么原因导致变异型PRV逃避经典Bartha疫苗免疫而发病，仍然是我们在研发新PRV疫苗时需要考虑的问题，新PRV疫苗在使用过程中对PRV进化存在何种影响也还需临床数据进行明确。此外，究竟其他动物是否应该免疫PRV疫苗，其他动物对PRV(经典型和变异型)是否存在差异，也是值得进一步研究探讨。

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(责任编辑：林海清)

Sequence Analysis on gB Gene from Pseudorabies Virus

CHEN Ru-jing, ZHOU Lun-jiang*, WU Xue-min, HUANG Xiao-feng, CHE Yong-liang, YAN Shan, WANG Chen-yan,WANG Long-bai, LIU Yu-tao, WEI Hong

(InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences/FujianAnimalDiseasesControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou,Fujian350013,China)

Since 2011, variant pseudorabies (PR) had occurred to the Bartha-k61 vaccinated pigs on farms in most provinces in China. The traditional Bartha-k61 vaccine could not prevent those pigs from contracting the viral disease. As a result, substantial financial losses had incurred to the porcine industry. A previous study indicated that there existed distinctive variations between the gE gene of the typical PR virus (PRV) and that of the variant PRV. For comparison, the sequence of the gB gene of the typical PRV was downloaded from GenBank. It was found that at Positions 395，453，562, and 739 they showed different characteristics, and their nucleotide homology was 98.1%-100% and amino acids 96.1%-100%. A phylogenetic analysis suggested that the viruses were from two different branches and differed significantly depending upon their geographic origins. In China, these viruses had different sub-branches. And, the variant PRV shared a same sub-branch in origin with the newly identifiedNyctereutesprocyonoidesand Yorkshire Terrier PR. The information obtained would be valuable for studying biological functions of gB as well as origin-tracing on variant PRV.

Pseudorabies virus;gBgene; sequence analysis

2016-04-01初稿；2016-05-16修改稿

陈如敬(1984-)，男，助理研究员，主要从事动物传染病研究 *通讯作者：周伦江(1973-)，博士，研究员，主要从事动物病毒分子生物学研究(E-mail: lunjiang@163.com)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1023-13、2014R1023-16)

S 852

：A

：1008-0384(2016)11-1139-06

陈如敬，周伦江，吴学敏，等.猪伪狂犬病毒gB基因序列分析[J].福建农业学报，2016，31(11)：1139-1144.

CHEN R-J，ZHOU L-J，WU X-M，et al.Sequence Analysis on gB Gene from Pseudorabies Virus[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1139-1144.