补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

叶淑静孙斯琪李 琳方 燕杨 琰储利胜

补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

叶淑静1孙斯琪2李 琳3方 燕3杨 琰3储利胜3

目的观察不同浓度补阳还五汤（BYHWD）含药血清对人脑微血管内皮细胞（HBMECs）增殖和迁移影响。方法补阳还五汤灌胃SD大鼠后腹主动脉取血，制备含药血清；体外培养人脑微血管内皮细胞（HBMECs），随机分为空白组（正常大鼠血清）及补阳还五汤含药血清组，血清浓度分为5%、10%和20%3个浓度，共6组；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测HBMECs增殖；细胞划痕法检测HBMECs迁移的相对距离。结果与空白组比较，5%、10%和20%含药血清均显著促进HBMECs增殖，差异有统计学意义（0.71±0.03比0.65±0.03、0.84±0.05比0.75±0.03、0.71±0.05比0.67± 0.05，孕＜0.05）；与10%含药血清组比较，5%含药血清组和20%含药血清组细胞增殖显著减少，差异有统计学意义（0.71±0.03、0.71±0.05比0.84±0.05，孕＜0.05）。与空白组比较，各含药血清组细胞迁移的相对距离均显著增加，差异有统计学意义（0.58±0.03比0.50±0.01、0.63±0.03比0.45±0.05、0.53± 0.05比0.45±0.04，孕＜0.05）；与10%含药血清组比较，5%含药血清组和20%含药血清组细胞迁移的相对距离显著减小，差异有统计学意义（0.58±0.03、0.53±0.05比0.63±0.03，孕＜0.05）。结论补阳还五汤含药血清可促进HBMECs增殖和迁移，10%含药血清作用最佳。

人脑微血管内皮细胞；血清；补阳还五汤；增殖；迁移

补阳还五汤具有益气、活血、通络的功效，是中医治疗脑缺血及其后遗症的代表方剂。我们实验室前期研究发现补阳还五汤促进脑缺血后神经功能恢复，机制与其诱导血管生成、神经发生和增加突触可塑性等有关[1-2]。本研究进一步在体外采用中药含药血清方法[3-4]，观察补阳还五汤含药血清对HBMECs增殖和迁移的影响，并确定补阳还五汤含药血清孵育最佳浓度，为后续进一步明确补阳还五汤促血管生成机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，3～4月龄，体质量180～200g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK（沪）2013-0016。饲养在浙江中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号:SYXK（浙）2013-0184，室温（22±1）℃，相对湿度40%～60%，12h明暗循环，自由饮食进水。

1.2 主要试剂及仪器 人脑微血管内皮细胞（HBMECs）（美国ATCC公司）；RPMI-1640培养基（杭州吉诺生物技术有限公司）；优级胎牛血清（美国Gibco公司）；含0.02%EDTA的0.05%胰酶（杭州吉诺生物技术有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（美国Sigma公司）。CO2细胞培养箱（日本三洋公司）；倒置相差显微镜（宁波永新光学技术有限公司）；低速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.3 药 物 补阳还五汤出自《医林改错》，组成:黄芪120g，当归6g，川芎、赤芍各4.5g，地龙、红花、桃仁各3g。药材购自浙江中医药大学中医门诊并经鉴定，以上各组药物加水浸泡2h，水煎2次，每次40min/次，合并后浓缩为含生药2g/mL药液。

2 方法

2.1 含药血清制备 将10只雄性SD大鼠随机分为空白对照组和补阳还五汤组，每组5只。补阳还五汤组灌胃13.3mL/（kg·d）的补阳还五汤液，空白对照组灌胃等量生理盐水，连续3天，每天2次，末次给药1h后腹主动脉取血，静置30min，4000rpm/min离心15min，分离血清，56℃灭活30min，0.22μm滤膜除菌,无菌分装，-20℃保存备用。

2.2 细胞培养及分组 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃ 5%CO2培养箱内培养HBMECs，待细胞生长至80%左右融合时，传代用于实验。HBMECs分为空白血清组（5%、10%、20%）、补阳还五汤含药血清组（5%、10%、20%），共6组，各组均采用RPMI-1640培养基。

2.3 MTT法检测细胞增殖活性 消化后收集细胞，调整细胞密度1×104个/mL，空白血清对照组（5%、10%、20%）、补阳还五汤含药血清组（5%、10%、20%），每个浓度设6个复孔。每孔100μL细胞悬液接种至96孔板，培养24h后，弃上清，每孔加入MTT溶液100μL，继续培养4h，弃培养上清液，每孔加入DMSO 150μL，室温置摇床震荡10min，于酶标仪上490nm检测吸光度测样品OD值。

2.4 细胞划痕实验 消化后细胞，按1×105个/孔接种至6孔板，放入培养箱培养24h，弃培养基，用20μL枪头在每个孔内垂直划3条直线，用PBS冲洗3次，加入补阳还五汤含药血清（5%、10%、20%）、空白血清对照（5%、10%、20%）培养基1mL培养24h后，倒置相差显微镜下观察拍摄。每组设4个复孔。用Image pro plus 6测量划痕的宽度。计算公式:细胞侵袭的相对距离=（划痕初始宽度-划痕后24h宽度）/划痕初始宽度。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析，所有数据以（±s ）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）并SNK进行组间比较，孕＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 HBMECs形态特征 HBMECs为贴壁细胞，小三角形，呈铺石路样,细胞生长较快，数量较多，见图1（封三）。

3.2 补阳还五汤含药血清对HBMECs增殖的影响

作用24h，与相同浓度空白组比较，5%、10%和20%含药血清均显著促进HBMECs增殖（孕＜0.05）；与10%含药血清组比较，5%含药血清组和20%含药血清组细胞增殖显著减少（孕＜0.05），见表1。

表1 不同浓度补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖的影响（OD值，±s）

表1 不同浓度补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖的影响（OD值，±s）

注:与相同浓度空白组比较，*孕＜0.05；与10%BYHWD含药血清组比较，△孕＜0.05；BYHWD:补阳还五汤

组别5%空白组5%BYHWD组10%空白组10%BYHWD组20%空白组20%BYHWD组孔数6 6 6 6 6 6 24h 0.65±0.03 0.71±0.03*△0.75±0.03 0.84±0.05* 0.67±0.05 0.71±0.05*△

3.3 不同浓度补阳还五汤含药血清对HBMECs迁移的影响 作用24h，与相同浓度空白组比较，5%、10%和20%含药血清组细胞迁移的相对距离均显著增加（孕＜0.05）；与10%含药血清组比较，5%含药血清组和20%含药血清组细胞迁移的相对距离显著减小（孕＜0.05），见表2、见图2（封三）。

表2 不同浓度补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞迁移的影响（±s）

表2 不同浓度补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞迁移的影响（±s）

注:与相同浓度空白组比较，*孕＜0.05；与10%BYHWD含药血清组比较，△孕＜0.05；BYHWD:补阳还五汤

组别5%空白组5%BYHWD组10%空白组10 BYHWD组20%空白组20%BYHWD组孔数4 4 4 4 4 4细胞迁移相对距离0.50±0.01 0.58±0.03*△0.45±0.05 0.63±0.03* 0.45±0.04 0.53±0.05*△

4 讨 论

缺血性脑卒中具有发病率、致死率、致残率高的特点，严重威胁人类生命健康。目前除了超早期溶栓治疗以外，尚缺乏其他有效的治疗方法。脑缺血后血管新生已成为临床脑卒中治疗的一种策略。

血管内皮细胞是单层单核细胞层，具有屏蔽功能、信息传递、参与血管形成及血管活动等[5-6]，能够分泌一些血管活性物质，调节血管张力防止血栓形成，抑制平滑肌细胞增殖等作用[7]，当内皮细胞受损后会分泌多种活性物质，与其他相关物质平衡被打破从而导致心脑血管系统功能障碍，如致死率极高的冠心病和脑卒中的发生[8]。已有研究[9-10]报道，在缺氧条件下，血管内皮生长因子大量表达，促进血管生成，增加缺氧组织的供血。因此，血管内皮细胞在促血管新生中起着重要的作用。

补阳还五汤是中药复方，是中医治疗脑缺血及其后遗症的代表方剂[11]。本研究前期发现补阳还五汤促进脑缺血后神经功能恢复，机制与其诱导血管生成有关[12]。本研究结果显示，10%补阳还五汤含药血清对HBMECs作用最佳，能显著促进HBMECs增殖和迁移，提示补阳还五汤含药血清可能是通过直接促进HBMECs增殖，促进HBMECs迁移，从而促进血管新生，这可能是补阳还五汤含药血清治疗脑卒中的一个重要途径，为更进一步探讨补阳还五汤含药血清的作用机制提供依据。

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（收稿:2016-05-02 修回:2016-06-10）

Effect of Buyang Huanwu Decoction on Proliferation and Migration of Human Brain Microvascular En-dothelial Cells

YE Shujing1,Sun Siqi2,LI Lin3,FANG Yan3,YANG Yan3,CHU Lisheng3. 1 TCM 孕harmacy,Hangzhou First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 College of 孕harmaceutical Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 College of Basic Medical Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate the effect of Buyang huanwu decoction（BYHWD）with different concentrations on the proliferation and migration of human brain microvascular endothelial cells（HBMECs）.MethodsThe abdominal aortic blood from SD rats treated with BYHWD was drawn to prepare drug-containing sera.HBMECs were cultured in vitro and randomly divided into blank groups（normal rat serum at 5%,10%and 20%concentrations,respectively）and BYHWD drug-containing serum groups（at 5%,10%and 20%concentrations,respectively）.The proliferation of HBMECs was determined by MTT,and the influence of migration was detected by cell scratch method.ResultsCompared with blank groups,drug-containing serum at 5%,10%and 20%concentrations significantly promoted cell proliferation（0.71 0.03 vs 0.65 0.03,0.84 0.05 vs 0.75 0.03,0.71 0.05 vs 0.67 0.05,all孕＜0.05）;compared with drug-containing group at 10%concentration,the proliferation of HBMECs was reduced with a significant difference in drug-containing group at 5%and 20%concentrations（0.71 0.03,0.71 0.05 vs 0.84 0.05,孕＜0.05）.The relative distance of HBMEC migration was longer in BYHWD groups than those in blank groups（5%：0.58 0.03 vs 0.50 0.01, 10%：0.63 0.03 vs 0.45 0.05,20%：0.53 0.05 vs 0.45 0.04;all孕＜0.05）.A significant reduction in relative distance of HBMEC migration was found in drug-containing groups at 5%and 20%concentrations compared to at 10%concentration（0.58 0.03,0.53 0.05 vs 0.63 0.03,孕＜0.05）.ConclusionBYHWD can promote the proliferation and migration of HBMECs and the effect is maximal when the concentration of the drug-containing sera is 10%.

human brain microvascular endothelial cells;sera;buyanghuanwu decoction;proliferation;migration

浙江省自然科学基金项目（No.Y207771）；浙江中医药大学基础医学院科技创新团队资助项目（No.YCIT2016-2）

1浙江中医药大学附属杭州第一医院中药房（杭州 310006）；2浙江中医药大学药学院（杭州 310053）；3浙江中医药大学基础医学院（杭州 310053）

储利胜，Tel:（0571）86633149；E-mail:chulisheng@21cn.com