沙棘浆超高压杀菌及多酚保留率研究

盛文军,毕 阳,韩舜愈,冯丽丹,米 兰,李霁昕

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)



沙棘浆超高压杀菌及多酚保留率研究

盛文军,毕 阳,韩舜愈,冯丽丹,米 兰,李霁昕

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

中国的沙棘加工以生产沙棘浆为主,传统热力杀菌导致多酚物质破坏,为在保证杀菌效果前提下,尽可能保留多酚物质,实验以细菌菌落总数为指标,选择杀菌压力、样品初始温度和杀菌时间三个因素,先对沙棘浆的超高压杀菌条件进行优化,然后将未杀菌、超高压杀菌以及热力杀菌沙棘浆中的没食子酸进行比较。结果表明,当杀菌压力500 MPa、杀菌时间15 min、沙棘浆初始温度30 ℃时,菌落总数从杀菌前1700 CFU/mL降到40 CFU/mL,降幅最大;方差分析表明杀菌压力和时间对指标影响显著(p<0.05)。每100 mL超高压杀菌的沙棘浆中含没食子酸11.3 mg,与未杀菌样品相比保留率达88.29%;热力杀菌样品测得每100 mL含没食子酸4.99 mg。由此得出,在满足微生物抑制前提下,超高压杀菌对多酚物质保留要优于热力杀菌。

沙棘,超高压杀菌,没食子酸,多酚保留率

沙棘作为胡颓子科沙棘属落叶灌木的子实,富含多种天然抗氧化成分如维生素C、维生素E、类胡萝卜素、花青素和多酚类化合物。主要种植区包括中国、俄罗斯、德国、芬兰、罗马尼亚、法国、尼泊尔、巴基斯坦和印度[1]。因其显著的抗氧化能力,沙棘在中国很早就作为药物和食材被利用[2]。各类报道中最多提到的是沙棘治疗烧伤和溃疡的疗效[3],另外还用于治疗皮肤病以及抑制心肌炎症[4]。有报道对于传统热力杀菌工艺造成沙棘浆非酶褐变以及5-羟甲基糠醛等指标变化规律进行研究,证实热力杀菌对上述指标产生影响[5-6]。

超高压(High hydrostatic pressure,HHP)杀菌是利用静水压力100～1000 MPa并在较低温度下对包装食品进行微生物灭活的技术。在食品领域的超高压杀菌研究始于1899年,美国科学家海特首次发现450 MPa压力处理可以延长牛奶保质期[7]。近些年越来越多的报道证实超高压技术对食品的影响包括了酶的失活、组织结构变化和化学反应速率变化等[8-11]。在国内有研究人员利用超高压技术对甘蔗汁、荔枝汁、椰子汁等产品进行灭菌实验,研究结果也证实该技术对于高酸度、流体类、热敏性食品的杀菌效果理想[12-18]。

表1 沙棘浆超高压杀菌单因素实验
Table 1 Single factor experiment of HHP on seabuckthorn puree

因素名称实验水平1实验水平2实验水平3实验水平4实验水平5实验水平6压力(MPa)100200300400500600杀菌时间(min)101520253035样品初温(℃)253035404550

目前中国沙棘种植面积已近3000万亩,沙棘加工技术亟待提高。现有报道中沙棘加工多集中于沙棘浆生产,和以沙棘浆为基料的发酵果酒以及调配饮料生产[19-22]。而且上述产品的抗氧化成分是其重要的商品特征之一,如何在加工过程中利用新技术提高其保留率,具有一定生产指导意义。实验拟选定杀菌压力、杀菌时间及沙棘浆初始温度三个因素,通过杀菌条件优化,并比较不同杀菌技术下样品中多酚物质保留情况,为将来沙棘加工中新技术的利用进行基础实验工作。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

扩展青霉(Penicilliumexpansum,CICC 40356) 中国工业微生物菌种保藏中心;金黄葡萄球菌(Staphylococcusauras,ATCC25923) 全球生物资源中心北京分部;沙棘浆 甘肃高原圣果沙棘开发有限公司提供(可溶性固形物18.3%),主要为橙色(Hippophea rhamnoides L. subsp.mongolia Rousi×Hippophea rhamnoides L. subsp.mongolia Rousi)、阿列伊(Hippophea rhamnoides L. subsp.mongolia Rousi×Hippophea rhamnoides L. subsp.caucasia Rousi)沙棘品种混榨;没食子酸(标准品,110831) 南京森贝伽生物科技有限公司;甲醇(色谱纯,CAS:67-56-1) 山东浩中化工科技有限公司;磷酸(色谱纯,CAS:7664-38-2) 天津市盛鑫源伟业贸易有限公司。

FR-900真空包装机 上海瑞泽包装机械有限公司;PYX-DHS水浴槽 上海跃进医疗器械有限公司;SW-CJ-1F超净工作台 上海苏净实业有限公司;600MPa-2L超高压食品处理设备 天津华泰森淼生物工程技术有限公司;高效液相色谱仪(Waters Delta 600泵,waters 2996 PDA检测器) 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘浆染菌 甘肃沙棘生长多为野生环境,附着微生物菌群相复杂且波动性强。因此实验中采用人工染菌方法,接种水果制品中较耐酸的扩展青霉及污染源广泛的金黄葡萄球菌,通过将目标菌种类固定化以及将其在沙棘浆中浓度控制在较一致水平,来提高超高压杀菌时指标对实验处理响应的精确性。

具体染菌方法是将高原圣果公司鲜榨沙棘浆由真空铝箔袋包装、经-10 ℃冷库冻藏24 h后由加工厂运至实验室,在振荡水浴槽里振荡复温至20 ℃后定量接种前述两种目标微生物。为保证杀菌前各样品袋中目标菌数量尽可能接近,扩展青霉在查氏琼脂(Czapek’s)液体培养基中活化12 h后稀释至10-9浓度,金黄葡萄球菌则在溶菌肉汤(LB)培养基中活化12 h后稀释至10-9稀释度,每1 L沙棘浆中两种菌的接种量均为5 mL菌悬液;接种后的沙棘浆分装于消毒聚乙烯袋(每袋20 mL)并存储在4 ℃冰箱备用。

1.2.2 细菌菌落总数计数 菌落总数检测按照GB 4789.2-2010执行[23];每个实验处理平行三个样品,结果取平均值。刚接种完的沙棘果浆立刻测定菌落总数作为空白对照数据;每次超高压杀菌前,随机选取三袋样本测定菌落总数,取其平均值作为阴性对照数据。

实验过程中,阴性对照菌落总数高于或等于空白对照,证实目标菌在样本中存活,方可进行后序实验,否则重新染菌制样并提高样品贮藏时温度至15 ℃;在杀菌实验中,各个实验处理后样本的菌落总数低于阴性对照,证明杀菌处理有效,否则重新染菌制样并且将两种目标菌的活化培养时间提高到24 h,稀释度减至10-5以提高染菌浓度。

1.2.3 超高压杀菌单因素实验 选择超高压设备操作参数“压力”和“时间”,以及对杀菌影响大的“样品温度”三个因素,按照表1设定实验水平进行单因素实验,压力和时间水平设置取设备上下限,温度下限取室温、上限不高于热力杀菌温度,当其中一个因素进行各水平实验时,其他两个因素固定在实验水平3。每个实验处理进行五袋平行样品测定,最终结果取平均值。

1.2.4 超高压杀菌响应面优化实验 单因素实验后,根据其结果进行Box-Behnken优化实验设计(BBD)。选取单因素实验中各因素的最优水平作为优化实验的零水平,选择尽可能涵盖次优水平的步长,从零水平数值计算得到“-1”和“+1”水平。实验设计编码及对应参数见表2。

表2 响应面优化实验编码及参数
Table 2 Codes and true values in BBD experiment

因素实验水平编码-101压力(MPa)400500600杀菌时间(min)101520样品初温(℃)253545

注:真实值基于单因素实验结果,见实验结果与分析。

1.2.5 沙棘浆中没食子酸检测

1.2.5.1 液相色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相:甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95);检测波长273 nm;流速0.8 mL/min;柱温25 ℃。进样3次,用峰面积按外标法积分计算[24-25]。

1.2.5.2 沙棘浆检测样制备 精确吸取沙棘浆1 mL,置于50 mL容量瓶中加甲醇30 mL,常温水浴振荡提取2 h,再加甲醇至刻度,摇匀后静置10 min,定量滤纸过滤后精密吸取1 mL滤液用甲醇定容到10 mL容量瓶得到供试液。另外精密称取没食子酸标准品2.55 mg,置50 mL容量瓶加甲醇至刻度,摇匀得对照品溶液。检测前两种溶液都经过微孔滤膜(0.45 μm)过滤,取10 μL进样。

1.3 数据统计分析

实验结果相关性及显著性分析借助软件Design Expert 7.1.3完成。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

当杀菌时间为20 min,试样初始温度为35 ℃时,经不同超高压处理压力杀菌的沙棘浆其菌落计数如图1所示。该批样本的空白对照其菌落总数为7.2×102CFU/mL,杀菌实验处理为样品冰箱贮藏3 d后进行,杀菌前测得的阴性对照菌落总数为1.53×103CFU/mL,阴性对照高于空白对照,可进行杀菌实验。当杀菌压力低于300 MPa,样品菌落总数在1.5×103CFU/mL水平,达到400 MPa时样品菌落总数突降到1.4×102CFU/mL,与阴性对照相比,抑制率达到91%。压力进一步增加至500 MPa时菌落总数下降到40 CFU/mL,对比阴性对照组抑制率达到99.9%,当压力达到实验设备上限压力600 MPa时,菌落总数为30 CFU/mL,抑制率仍为99.9%。根据单因素实验结果,在响应面优化实验中压力“零水平”选500 MPa。

图1 超高压杀菌压力对沙棘浆菌落总数的影响Fig.1 Effect of pressure on aerobic bacterial count of seabuckthorn puree

超高压杀菌时间和压力的单因素实验为同一天进行,该批样本的空白对照其菌落总数为7.2×102CFU/mL,冰箱贮藏3 d后进行实验,杀菌前测得阴性对照菌落总数为1.53×103CFU/mL,阴性对照高于空白对照,可进行杀菌实验。在杀菌时间单因素实验中,沙棘浆菌落总数未出现突降情况,处理时间15 min样品菌落总数在141 CFU/mL水平,这一水平与处理时间35 min时144 CFU/mL没有差异性(p=0.05),基于优选杀菌时间最短原则,选取15 min作为优化实验中的“零水平”,结果显示在图2。

图2 超高压杀菌时间对沙棘浆菌落总数的影响Fig.2 Effect of processing time on aerobic bacterial count of seabuck-thorn

初始温度单因素实验为样品贮藏第4天进行,空白对照菌落总数为7.2×102CFU/mL,阴性对照菌落总数为1.57×103CFU/mL,阴性对照高于空白对照,可进行杀菌实验。沙棘浆的初始温度与超高压杀菌后样品菌落总数呈近似于直线型相关(R2=0.9906),在实验选定的温度区间考察指标未出现突降或起伏,这与其他品种果汁的超高压杀菌报道文献有所不同[26-27],理论上实验温度区间尚可进一步扩展,但低温端目前超高压杀菌设备都以近室温作为杀菌温度起点,外源制冷没有生产意义;高温端从技术上可以再提高,但温度超过50 ℃时,与目前沙棘浆采用的热杀菌预热温度已几乎相同。因此,选择温度区的中心35 ℃作为优化实验零水平,步长涵盖25 ℃和45 ℃。

图3 沙棘浆初始温度对杀菌后菌落总数的影响Fig.3 Effect of seabuck-thorn puree temperature on aerobic bacterial count after HHP

2.2 Box-Behnken优化实验

表3是优化实验处理及结果,由其得到实验选定三个因素对指标的二次回归方程如下:

表4 响应面实验二次回归结果方差分析
Table 4 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

变异来源平方和自由度均方F值p值显著性模型42761999475133146100009显著X1压力3062813130628139419<00001∗∗X2温度4500014500013802779X3时间262813126281380800249∗∗X1X21000011000003105965X1X3140625114062543200761∗X2X32250012250006904330X127207961720796221700022∗∗X222290112290107004291X325331533001609017残差227625732518失拟项1562535208009809569不显著纯误差212000453000总回归450382416R2=09495 R2Adj=08845 R2Pred=08709

注:p<0.05为极显著**;p<0.10 为显著*。

Y=56.00-61.88 X1+7.50X2-18.13X3-5.00X1X2+18.75X1X3-7.50X2X3+41.38X12-7.38X22-1.12X32,由方程给出的三组最优条件中,第一位优化条件为杀菌压力500 MPa,样品温度20 ℃,杀菌时间20 min。

表3 Box-Behnken优化实验结果
Table 3 Running Sheet of Box-Behnken Design and Results

因素交互作用对指标的影响如图4所示。

图4 因素交互作用对指标的影响Fig.4 The surface and contour plots for the aerobic plate count of seabuckthorn puree as a function of dindependent variables

图4中A、B、C分别表示“温度与压力”、“时间与压力”以及“时间与温度”三组因素交互作用对菌落总数的影响。在A图中,当温度变化从20 ℃升至30 ℃同时压力从400 MPa升到500 MPa过程中,菌落总数处于快速下降阶段,达到最佳值为57.5 CFU/mL时变化趋稳;在B图中,当压力从400 MPa向550 MPa变化,同时时间从10 min加大到20 min,也是菌落总数产生快速下降的区域。以上各参数区间,成为超高压技术用于沙棘浆杀菌的敏感区域。在图C中,因素交互作用对于指标影响处于平滑变化过程,相对于两个因素本身的影响,因素交互作用并没有表现出明显的协同作用。

2.3 不同沙棘浆没食子酸检出量比较

根据超高压杀菌实验的第一优化条件,另外参考甘肃高原圣果沙棘有限公司沙棘浆热力杀菌条件(90 ℃,40 min),取染菌后未杀菌的沙棘浆作对照,各取三袋平行样品,在20 ℃下比较三种沙棘浆中没食子酸检出量,结果见表5。

表5 不同沙棘浆中没食子酸检出量比较
Table 5 The concentration of gallic acid in different seabuckthorn puree

没食子酸(mg)样品(100mL)染菌未处理90℃，40min热力杀菌500MPa，20min超高压杀菌测试113175011132测试213214771109测试313095201137结果1316±004499±0151126±011

注:测试1、2、3结果为各袋独立实测数据,最终结果以平均值±标准差表示。

在三种处理比较中,染菌未处理沙棘浆作为对照,每100 mL样品中没食子酸检出量为13.16 mg,而超高压杀菌样品每100 mL含没食子酸检出量达到11.26 mg,接近对照组的88.08%,热力杀菌样品指标下降显著,每100 mL含没食子酸检出量为4.99 mg,为对照组的37.92%。从指标变异程度看,热力杀菌和超高压杀菌程度相近,提示与染菌浆相比,两种杀菌方法对于沙棘浆中的酚类物质都产生影响,而超高压杀菌比热力杀菌对酚类物质保留更多。

3 结论与讨论

通过实验,初步确定优化后的超高压杀菌条件,即杀菌压力500 MPa,样品初温20 ℃,杀菌时间20 min,可用于沙棘浆的微生物灭活要求;在满足微生物安全性的前提下,超高压杀菌比热力杀菌对于酚类物质的保留要高,这与相关报道[12]中比较超高压(HHP)与高温瞬时(HTST)杀菌对甘蔗汁品质影响较一致;也有文献对超高压杀菌后不同品种猕猴桃汁的酚类物质影响进行实验分析,发现超高压杀菌后猕猴桃汁中的酚类物质升高[17],本次实验未见该实验现象。超高压杀菌时,沙棘浆的初始温度与杀菌效果呈线型相关,提高样品初温有利于杀菌,但若考虑酚类等热敏成分保留,则选择响应面实验结果给出的几组最优工艺中的哪一组参数,成为该技术应用于生产的关键。针对沙棘加工中热敏物质损失,国内外有报道采用真空冻干、喷雾干燥、渗透脱水,或亚临界直接提取活性成份等技术予以预防[26-30],如果兼顾微生物安全和热敏物质保留,超高压杀菌显示一定优势。

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Optimization of high hydrostatic pressure sterilization on seabuckthorn puree & polyphenols retention

SHENG Wen-jun,BI Yang,HAN Shun-yu,FENG Li-dan,MI Lan,LI Ji-xin

(College of Food Science & Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

By far,the seabuck-thorn puree manufacturing is still the first chosen technology in China. In this process,the thermal sterilization which was unavoidable causes the decomposition of polyphonels. To test the polyphenols retention through the sterilization,the trial optimization of the parameters via the high hydrostatic pressure(HHP)process was exerted with three chosen parameters listed as the pressure,the temperature of puree and the processing time firstly. Then a comparison of gallic acid presented polyphonels contented in three samples included the original,the HHP and the thermal was compared. The results proved a maximum decrease of the aerobic plate count from 1700 CFU/mL to 40 CFU/mL when the HHP parameters were the following:pressure of 500 MPa,processing time of 15 min and the initial sample temperature of 30 ℃. Furthermore,the ANOVA showed the pressure and the processing time performed highly significant influences on the index(p<0.05). The comparison of gallic acid among three mentioned samples showed the seabuckthorn puree via HHP contained 11.3 mg pyrogallo per 100 mL which was as 88.29% as those from the original puree. Contrastively,the thermal sterilized puree contained gallic acid 4.99 mg. The outcomes indicated that the HHP processing could be potentially superior to the thermal sterilization in the preservation of polyphonels,in the premise of satisfying the microbial inactivation.

seabuckthorn;high hydrostatic pressure process(HHP);gallic acid;polyphenols retention

2016-06-03

盛文军(1975-)，男，硕士，讲师，从事果品蔬菜加工研究，E-mail:shengwj@126.com。

国际科技合作重点项目计划(2014DFR31230)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)23-0216-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.032