亚临界水萃取麦胚蛋白及其功能特性的研究

张海晖,李长征,罗孝平,段玉清

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)



亚临界水萃取麦胚蛋白及其功能特性的研究

张海晖,李长征,罗孝平,段玉清*

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

以小麦胚芽为原料,通过单因素和响应面分析实验对亚临界水萃取麦胚蛋白的工艺条件进行优化,并对其功能特性进行评价。结果表明,麦胚蛋白最佳提取条件为:萃取温度130 ℃,萃取时间15 min,料水比1∶20 g/mL,pH为9.4。在此条件下,麦胚蛋白的提取得率达42.25%,乳化活性为113.63 m2/g,乳化稳定性为82.16%,起泡性为71.45%,起泡稳定性为36.05%,持水性为4.21%,持油性为4.49%,溶解度为60.93%。与传统碱溶酸沉法相比,亚临界水萃取麦胚蛋白在提取时间、提取率等方面均具有明显优势。

小麦胚芽,蛋白,亚临界水萃取

小麦胚芽是面粉加工过程中的副产物,约占整粒小麦重量的3%,常作为饲料出售,导致宝贵的小麦胚芽资源未能被合理、有效地利用[1-2]。小麦胚芽中蛋白质含量高达30%,仅次于大豆[3-5]。而且,麦胚蛋白是一种完全蛋白,必需氨基酸组成也合理[6-10]。因此,小麦胚芽是重要的优质植物蛋白源,研究麦胚蛋白提取工艺对小麦胚芽资源的开发和利用具有重要意义。

对于麦胚蛋白的分离制备,国内外常采用碱溶酸沉法进行研究[5,11-17],但提取得率通常较低。1996年N.S. Hettiarachchy等[18]最先采用传统的碱溶酸沉法从脱脂麦胚中提取麦胚蛋白,其得率仅为28%。其功能特性实验结果表明,麦胚蛋白的溶解性和泡沫稳定性较差。而亚临界水萃取技术是近年来发展起来的新型提取技术,其使用纯水作为溶剂,避免有机溶剂的应用和污染,且具有提取时间短、萃取效率高、环境友好等优点,是一种具有潜力的绿色提取技术,在植物有效成分提取领域有着广阔的应用前景[19-27]。近年来本课题组先后将亚临界水技术用于米糠、板栗、莲子蛋白的提取,均取得明显成效[20,28-29]。基于此,本文利用亚临界水萃取技术,研究麦胚蛋白的萃取参数,确定最佳工艺,并对亚临界水萃取的麦胚蛋白的功能特性进行研究,以期解决碱溶酸沉法提蛋白溶出率低的技术问题,为小麦胚芽资源的综合开发与利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦胚芽 江南面粉厂。

石油醚,乙醇,磷酸钠,氯化钠,浓硫酸,硫酸铜,氢氧化钠,考马斯亮蓝G-250,盐酸,硼酸,磷酸,磷酸氢二钠,十二烷基磺酸钠等均为分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司。

亚临界水反应釜 镇江丹徒环球机电配件厂;Sartorius BSl10S型电子精密分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;DL-5C离心机 上海安亭有限公司;UV-1601紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;ALPHAI-4/2-4 型冷冻干燥机 德国 CHRIST公司;pHS-29A型酸度计 上海精密科学仪器有限公司;HH-S4恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;DZF6000电热鼓风干燥箱 上海东麓仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 基本成分的测定 粗蛋白含量的测定:采用凯氏定氮法(GB/T5009.5-2010);水分含量的测定:采用105 ℃恒重法(GB/T5009.3-2010);灰分的测定:采用灰化法(GB/T5009.4-2010);粗脂肪含量的测定:采用索氏抽提法(GB/T5512-2008);淀粉含量的测定:采用酸水解法(GB/T15683-2008)。

1.2.2 可溶性蛋白质含量的测定 可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[30]。以牛血清蛋白为标准品,测定可溶性蛋白的含量,并以牛血清蛋白浓度(μg/mL)为横坐标(x),其吸光度为纵坐标(A595 nm),得到的标准曲线为y=0.0059x+0.025(R2=0.9937)。麦胚蛋白的提取得率:Y(%)=CV/M×100

C为可溶性蛋白浓度(mg/mL);V为提取液的体积(mL);M为脱脂后麦胚蛋白质干重(g)。

1.2.3 亚临界水萃取 提取工艺为:小麦胚芽→石油醚脱脂→脱脂麦胚→加入一定量的蒸馏水(调成一定pH)→放入萃取釜(控制适当温度和时间)→冷却→离心(4500 r/min,20 min)→取上清液,测定蛋白含量,计算蛋白的提取得率→等电点沉淀(pH4.0)→离心(4500 r/min,20 min)→收集沉淀→冷冻干燥→麦胚蛋白粉末

1.2.4 碱溶酸沉法参考文献方法 提取工艺为[5]:小麦胚芽→石油醚脱脂→脱脂麦胚→按料水比 1∶15 g/mL加入pH9.5的蒸馏水→45 ℃下□提1 h→离心(4500 r/min,20 min)→取上清液,测定蛋白含量,计算蛋白的提取得率→等电点沉淀(pH4.0)→离心(4500 r/min,20 min)→收集沉淀→冷冻干燥→麦胚蛋白粉末

1.2.5 亚临界水萃取麦胚蛋白的单因素实验 时间:在料水比为1∶20,pH为10,温度为140 ℃的条件下,考察不同时间(5、10、15、20、25 min)对蛋白提取得率的影响。

温度:在提取时间为15 min,料水比为1∶20,pH为10的条件下,考察不同萃取温度(100、110、115、120、130、140、150、160、170、180 ℃)对蛋白提取得率的影响。

pH:在提取温度为120 ℃,时间为15 min,料水比为1∶20的条件下,考察不同pH(7、8、9、10、11)对蛋白提取得率的影响。

料水比:在pH为9,时间为15 min,提取温度为120 ℃的条件下,考察不同的料水比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对蛋白提取得率的影响。

1.2.6 响应面分析实验 在单因素实验的基础上,以麦胚蛋白的提取率为响应值,根据Box-Behnken中心组合原理,选择萃取时间、萃取温度、pH和料水比为主要因素,选取3个中心点进行29个实验,实验设计因素及水平见表1。

表1 实验因素水平表
Table 1 Table of factors and levels

水平因素X1萃取时间(min)X2温度(℃)X3pHX4料水比(g/mL)-11010081∶1501512091∶20+120140101∶25

1.2.7 麦胚蛋白功能性质的测定 将两种提取方法得到的麦胚蛋白粉末,参照文献方法[20],分别对其溶解度、持水(油)性、乳化活性及乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性进行功能性质测定。

2 结果与分析

2.1 脱脂麦胚基本成分分析

表2所示为脱脂麦胚的成分测定。从中可以看出,脱脂麦胚中的淀粉含量最高,占56.46%,其次是蛋白质,占28.21%。

表2 脱脂麦胚各组分含量
Table 2 Componential contents of defatted wheat germ

成分粗蛋白质淀粉脂肪水灰分含量(%)28215646109865559

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 时间对蛋白提取得率的影响 结果如图1所示。

图1 提取时间对蛋白得率的影响Fig.1 Influence of extracting time on the yield of protein

从图1可以看出,随着时间的延长,提取得率逐渐增大,在15 min时达到最大值,从15 min以后提取得率略微下降,可能是由于萃取时间过长,在高温条件下使部分蛋白发生变性,或淀粉发生糊化,阻碍蛋白的溶出,导致蛋白含量降低。因此,选取时间为15 min为宜。

2.2.2 温度对蛋白提取得率的影响 结果如图2所示。

图2 提取温度对蛋白得率的影响Fig.2 Influence of extracting temperature on the yield of protein

从图2可以看出,当温度低于120 ℃,温度越高,越有利于蛋白质的溶出,但当温度高于120 ℃,蛋白提取得率开始下降,可能是因为麦胚粉中蛋白质变性和淀粉糊化所引起。蛋白质变性会导致溶解度的降低,淀粉的糊化使原来的悬浮液变成了黏性很强的淀粉糊,阻碍了蛋白质的溶出,从而降低了麦胚蛋白的提取得率。因此,选取提取温度为120 ℃。

2.2.3 pH对蛋白提取得率的影响 结果如图3所示。

图3 pH对蛋白得率的影响Fig.3 Influence of pH on the yield of protein

从图3可以看出,随着pH的增大,麦胚蛋白的提取得率先增加后减少,在pH为9时蛋白提取得率最大,碱性过强会引起蛋白脱氨、脱酸、肽键断裂等不良化学反应,使部分蛋白发生变性,导致蛋白得率下降。因此综合考虑选择提取的pH为9.0。

2.2.4 料水比对蛋白提取得率的影响 结果如图4所示。

图4 料水比对蛋白得率的影响Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on the yield of protein

从图4可以看出,随着料水比的增加,蛋白提取率逐渐增大,当料水比为1∶20 g/mL时,达到最大值,之后随着料水比的增加,提取得率基本不变。考虑到料水比过大,会降低固形物的含量,不利于后续实验处理。因此,选取料水比为1∶20 g/mL。

2.3 响应面实验结果和方差分析

2.3.1 回归方程的模型建立及显著性检验 根据表3通过Design-Expert 7.1.3统计分析软件对所得的实验数据进行回归分析,建立响应面的回归模型,进而寻求最优响应值的因素水平。从表4中可以得出X1X4和X3X4不显著,其它项均显著。去除非显著项,确定回归模型方程为:Y(%)=41.66+2.03X1+2.98X2+1.48X3-1.36X4-1.36X1X2-1.43X1X3+0.7X1X4+1.05X2X3-1.50X2X4-0.85X3X4-3.54X12-4.30X22-2.87X32-2.41X42。从表4中可以看出模型的p值远远小于0.01,这说明Quadratic模型是高度显著的,同时软件还计算出,失拟误差不显著,回归方程的决定系R2为0.9747,这说明回归方程与实际数据之间具有良好的拟合性。从表4中可知,模型的一次项X1、X2、X3和X4,二次项X12、X22、X32及X42,交互项X1X2、X1X3、X2X3和X2X4均显著。这说明响应值的变化十分复杂,实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,而是呈二次关系。各因素对麦胚蛋白提取得率大小的影响依次为萃取温度(X2)>萃取时间(X1)>pH(X3)>料水比(X4)。

表3 响应面分析方案及结果
Table 3 The plan and results for response surface methodology

实验号X1X2X3X4提取得率(%)1-100-136552001136073-1-100269940-10-1319750000419760-1-1032367101038018-11003708900004101101-100329511-10013193120-101320313001-13975141001369515-10-1029261601-1035221700004108180-11032331900004127200000429521010-1404922100-138792301103941241100375925-101035562600-1-134682710-10374328010134572900-113439

表4 回归系数的显著性检验
Table 4 Significance test of each regression coefficient

方差来源平方和自由度均方F值p值显著性X14941149415921<00001∗∗X21063911063912749<00001∗∗X32637126373160<00001∗∗X4221112211265000001∗∗X1X2743174389000099∗∗X1X3818181898000074∗∗X1X4193119323201504X2X3445144553400367∗X2X48941894107100056∗∗X3X4287128734400847X128129181299741<00001∗∗X221200811200814390<00001∗∗X325334153346392<00001∗∗X423752137524496<00001∗∗

注:*显著性水平5%;**显著性水平1%。

表5 回归模型方差分析
Table 5 Analysis of variance for the fitted regression model

变异来源平方和自由度均方F值p值模型432.421430.8937.01<0.0001残差11.68140.83失拟项9.01100.91.350.4147纯误差2.6740.67总和444.1028复相关系数R2=0.9737

2.3.2 响应面曲面和等高线分析 响应面图形是响应值对应于实验因素所构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高线图[31]。响应面图形可以直观地反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响。

图5(a)显示温度和时间的交互作用对蛋白提取得率的影响。当时间固定不变时,随着温度的增加蛋白提取得率先增加后减少,可能是由于温度的升高,物料内部分子的动能增加,蛋白质分子与水分子间的氢键形成更多的缘故,有利于蛋白质的溶出。当温度过高时,使物料体系中淀粉开始部分糊化,增加了料液的粘度,不利于蛋白的溶出,从而使蛋白得率下降。当温度不变时,随着时间的增加蛋白的提取得率先增加后趋于稳定。

图5(b)显示pH和萃取时间的交互作用对蛋白提取得率的影响。当时间固定不变时,随着pH的增加蛋白提取得率逐渐升高并可达到最大值,当pH继续增加时蛋白的率稍微下降,由此得出,在一定pH和时间条件下,可使蛋白提取得率达到最大。当pH固定不变时,随着时间的增加蛋白提取得率逐渐增加然后趋于稳定。

图5(c)显示料水比和萃取时间的交互作用对蛋白提取得率的影响。当料水比固定不变时,随着时间的增加蛋白提取得率先增加后稍微降低。当时间固定不变时,随着料水比的增加,蛋白提取得率逐渐增大。

图5(d)显示pH和温度的交互作用对蛋白提取得率的影响。当pH固定不变时,随着温度的增加蛋白的提取得率先增加后减少。当温度固定不变时,随着pH的增加蛋白提取得率先增加后稍微降低。

图5(e)显示料水比和温度的交互作用对蛋白提取得率的影响。当料水比固定不变时,随着温度的增加,蛋白提取得率逐渐增大,达到最大后趋于稳定。当温度固定不变时,随着料水比的增加,蛋白提取得率先增加后减少。

图5(f)显示料水比和pH的交互作用对蛋白提取得率的影响。当pH固定不变时,随着料水比的逐渐增加,蛋白提取得率逐渐增加然后稍微降低。当料水比固定不变时,随着pH的增加,蛋白提取得率逐渐增大。

图5 各两因素交互作用的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction between the two factors

2.3.3 验证性实验 为表明模型的合适性和有效性,进行验证性实验。通过响应面分析得出最佳提取条件为:萃取温度为129.40 ℃,萃取时间为14.35 min,料水液比为1∶20 g/mL,pH9.40。考虑到实际操作,将麦胚蛋白的提取条件修正为萃取温度为130 ℃,萃取时间为15 min,料水比为1∶20 g/mL,pH9.4。在最佳条件下,重复实验3次,麦胚蛋白提取得率实际值为42.25%±0.51%,接近模型预测值43.05%。而传统碱溶酸沉法提取得率仅为28.13%。因此,采用RSA法优化得到的提取工艺参数准确可靠,具有一定的实用价值,与传统方法相比,在得率和时间上具有明显优势。

2.4 麦胚蛋白的功能性质

蛋白质制品在食品工业的应用性能取决于其功能特性,本实验对麦胚蛋白的溶解性、起泡性、乳化性、持水性、持油性进行了研究,测定结果见表6,从表中可以看出,亚临界水萃取得到的蛋白的功能特性优于传统碱溶酸沉法提取的蛋白的功能特性。

表6 麦胚蛋白功能性质
Table 6 Function characteristics of protein from Wheat germ

参数提取方法传统碱溶酸沉亚临界水萃取乳化活性(m2/g)1015111363乳化稳定性(%)82278216起泡性(%)70027145泡沫稳定性(%)35013605持水性(%)392421持油性(%)425449溶解度(%)56416093

3 结论

通过单因素和响应面分析实验优化出亚临界水萃取麦胚蛋白的最佳工艺条件为:萃取温度为130 ℃,萃取时间为15 min,料水液比为1∶20 g/mL,pH为9.4。在最佳条件下,麦胚蛋白的萃取得率达42.25%,其蛋白的功能性质优于传统碱溶酸沉法提取的蛋白。

亚临界水萃取麦胚蛋白同碱溶酸沉法相比具有提取时间短、萃取效率高、易于操作等优势,是一种具有潜力的绿色提取技术,具有广阔的应用前景。

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Study on the extraction of wheat germ protein by subcritical water and its functional properties

ZHANG Hai-hui,LI Chang-zheng,LUO Xiao-ping,DUAN Yu-qing*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

The extraction condition of wheat germ protein by subcritical water was optimized using single factor and response surface methodology and the functional characteristics of wheat germ protein were studied. The results showed that under the optimum extraction parameters obtained from response surface analysis,the yield of protein in the extracts was 42.25% at pH9.4,130 ℃for 15 min with the solid-liquid ratio of 1∶20 g/mL. In addition,the emulsion activity index of wheat germ protein extracted by subcritical water was 113.63 m2/g,and the emulsion stability indicator was 82.16%;the foamability and the foam stability were 71.45% and 36.05%,respectively;the water/oil absorption and the solubility were respectively 4.21%,4.49% and 60.93%. Compared with traditional alkaline-soluble acid precipitation method,subcritical water extracting wheat germ protein has obvious advantages in saving time,extraction yield.

wheat germ;protein;subcritical water extraction

2016-05-12

张海晖(1975-),男,博士,副教授,硕士生导师,研究方向:农副产品活性因子提取分离,E-mail:zhanghh@mail.js.edu.cn。

*通讯作者:段玉清(1973-)，女，博士，教授，研究方向：药食同源物有效成分、生物活性及其分子机制研究，E-mail:dyq101@mail.ujs.edu.cn。

国家自然科学基金(31371734);江苏大学人才基金(05JDG013,128300289)。

TS210.9

B

1002-0306(2016)23-0193-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.028