花生粕固态发酵产纳豆激酶的工艺优化

王艳平,胡迎芬,魏玉西,张源洁,刘 青

(青岛大学生命科学学院,山东青岛 266071)



花生粕固态发酵产纳豆激酶的工艺优化

王艳平,胡迎芬*,魏玉西,张源洁,刘 青

(青岛大学生命科学学院,山东青岛 266071)

探索纳豆菌固态发酵花生粕制备纳豆激酶的最佳工艺条件。以纳豆激酶活力为主要评价指标,在单因素实验基础上,通过正交实验优化花生粕固态发酵制备纳豆激酶的工艺条件。得出最佳发酵条件:发酵温度37 ℃,发酵时间24 h,接种量10%,料液比1∶0.4 g/mL。在此条件下测得发酵产物的纳豆激酶活力达到3162 U/mL,比单因素最高酶活提高了18%(2680 U/mL),可溶性氮含量为5.6 mg/mL,羟自由基清除率为74%,铁还原力的OD值为0.906。

花生粕,纳豆芽孢杆菌,纳豆激酶,固态发酵

血栓是由纤维蛋白原和血小板聚集形成的[1],常引发一系列疾病,是一种严重危害人类健康的心血管疾病[2]。纳豆激酶(nattokinase简称NK,是由纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilislnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶[3]。纳豆激酶已被证实是一种治疗心脑血管疾病的理想候选药物,与其他传统溶栓药相比,具有安全性好、成本低、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长等诸多优点[4]。因此,纳豆激酶作为新一代治疗血栓的有效药物,具有较广阔的开发和应用前景。

花生粕(PNM)是花生仁经压榨提炼油料后所得的副产品,其粗蛋白质含量为38.0%～47.0%,粗纤维含量为4.0%～7.0%,粗脂肪含量为0.5%～2.0%[5]。现多采用热压榨工艺提取花生油,导致花生蛋白过度变性,附加值降低,只能用于禽畜水产饲料,这极大限制了花生粕粗蛋白在食品和非食品领域的有效利用[6]。目前利用微生物发酵花生粕制备抗氧化肽的研究较多,明强强[7]利用酵母菌、乳酸菌、黑曲霉等五种微生物固态发酵花生粕,探索制备抗氧化肽的工艺条件。刘红梅[8]运用枯草芽抱杆菌AS1.398、地衣芽孢杆菌2709和植物乳杆菌等四种微生物液态发酵制备花生抗氧化肽。但利用纳豆菌发酵花生粕制备纳豆激酶的研究鲜见报道。

本研究以纳豆芽孢杆菌为发酵菌种,通过单因素实验和正交实验的方法考察了发酵时间、温度、接种量、料液比和营养盐加入量等对发酵液纳豆激酶活力的影响,并测定了最佳发酵产物的抗氧化活性。为降低纳豆激酶的生产成本提供理论依据和技术支持,为花生粕的高值化利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纳豆菌 分离于日本高野纳豆,由青岛大学食品工程实验室保存;花生粕 青岛嘉里植物油厂提供;豆粕、大豆、麸皮、燕麦 市售;纤维蛋白原(1 g/瓶)、凝血酶((酶活力150 BP/支) 中国药品生物制品检定所;尿激酶(10万单位/瓶) 南京南大药业有限责任公司;其余试剂均为国产分析纯。

721G可见分光光度计 上海精密仪器有限公司;YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实验有限公司;CR21GⅢ高速冷冻离心机 Hitachi Koki Co.,Ltd;BDC-208K/A冰箱 青岛海尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 斜面培养基 营养琼脂,121 ℃灭菌20 min;种子液培养基 蛋白胨1.0%,牛肉膏0.5%,氯化钠0.3%,葡萄糖1.0%,酵母膏0.5%,121 ℃下灭菌20 min;发酵培养基 花生粕(过20目筛)、豆粕、麸子、燕麦、大豆按一定比例混合均匀,121 ℃下灭菌20 min。

1.2.2 纳豆菌种子液的制备 无菌环境下,将保存于冰箱中的斜面菌种挑出1～2环到灭菌后的新鲜斜面培养基上,在37 ℃培养箱中培养24 h[9]。将活化好的菌株在无菌条件下挑取1～2环到种子培养液中,37 ℃、160 r/min的条件下振荡培养一定时间,作为发酵种子液,备用。

1.2.3 生长曲线的绘制 将1.2.1制备的纳豆菌种子液,每隔3 h取样,测定660 nm处的OD值,以未接种的种子培养液为空白对照,作出种子的生长曲线,确定接入发酵培养基的种龄。

1.2.4 工艺流程 花生粕固体培养基经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,自然冷却至55 ℃ 以下。在无菌条件下,将活化好的纳豆菌种子液喷洒于发酵培养基中(30 g)搅拌均匀,于200 mL的烧杯中铺成薄层,纱布封口,经发酵、后熟后,加入生理盐水,4 ℃浸提2 h,10000 r/min离心10 min,取上清液备用。

1.2.5 单因素实验设计 基本发酵条件:料液比1∶0.5 g/mL,37 ℃,发酵24 h,后熟24 h。依次改变发酵温度、接种量、发酵时间、料液比和营养盐,考察各单因素对纳豆激酶活力与可溶性氮含量的影响。各因素研究的水平分别为:发酵温度:29、33、37、41、45 ℃;接种量:2%、4%、6%、8%、10%;发酵时间:12、18、24、30、36 h;料液比:1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6;营养盐:E1添加组(1.5%蔗糖、0.21%硫酸镁、0.27%氯化钙),E2不加组。

1.2.6 正交实验设计 根据单因素实验结果,选择温度、时间、接种量和料液比四个影响较为显著的因素进行正交实验,实验设计见表1。

表1 因素与水平排列
Table 1 Arrangement of factors and levels

水平因素A温度(℃)B时间(h)C接种量(%)D料液比(g/mL)1331861∶042372481∶0534130101∶06

1.3 测定方法

1.3.1 纳豆激酶活力的测定

1.3.1.1 尿激酶标准曲线的制作 参照Astrup[10]等的方法并做适当改进,以尿激酶标准品单位数的对数为纵坐标,溶解圈垂直两直径乘积的对数为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。

1.3.1.2 花生粕发酵物纳豆激酶活性测定 取上清液点样于纤维蛋白平板上,37 ℃孵育18 h,测量溶解圈的垂直两直径,两直径乘积的对数代入回归方程,计算样品酶活力,每组数据均平行测定3次。

1.3.2 可溶性氮含量的测定 参照明强强等[11]的方法测定。

1.3.3 抗氧化活性的测定 羟自由基清除率、铁还原力按照Yu等[12]方法测定。

2 结果与讨论

2.1 菌种生长曲线

纳豆菌的生长曲线见图1,在0～12 h内,纳豆芽孢杆菌生长速度较慢,处于延滞期;12 h后纳豆芽孢杆菌生长迅速,进入对数生长期;21 h开始纳豆芽孢杆菌生长变缓,菌数趋于稳定,进入稳定期;30 h开始纳豆芽孢杆菌数量开始减少,进入衰亡期。有研究认定,处于对数生长期的菌种接种发酵培养基后适应性强、产酶活性高[13]。因此,确定纳豆菌的最适种龄为18 h。

图1 纳豆菌种的生长曲线Fig.1 Strain growth curve

2.2 尿激酶标准曲线

尿激酶活力标准曲线见图2,回归方程为y=4.9864x+0.5141,R2=0.9947。

图2 尿激酶标准曲线Fig.2 Standard curve of urokinase activity

2.3 单因素实验结果

2.3.1 发酵温度对发酵效果的影响 发酵温度对发酵效果的影响如图3所示,在29～45 ℃范围内,纳豆激酶活力呈现先增加后减小的趋势,在发酵温度为37 ℃时,纳豆芽孢杆菌产酶活力最高;可溶性氮含量也呈现先增加后减少的趋势,温度为41 ℃时,可溶性氮含量最高。菌种的生长对温度要求较高,在适宜温度范围内,纳豆芽孢杆菌才能快速生长繁殖,产生大量的蛋白酶水解底物蛋白。当温度高于纳豆杆菌适宜的生长范围时,纳豆杆菌的生长繁殖受到抑制,导致菌体数量减少。综合评价发酵温度对这2个指标的影响,确定33～41 ℃作为正交实验发酵温度范围。

图3 发酵温度对发酵效果的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on fermentation results

2.3.2 接种量对发酵效果的影响 图4为接种量对发酵效果的影响。可见接种量在2%～10%范围内,发酵液中纳豆激酶活力先增加后减小,接种量8%时纳豆激酶活力最高。可溶性氮含量的增加趋势与酶活变化基本一致。随着接种量的增加,菌种生长繁殖过程中产生的蛋白酶量增多,蛋白水解生成的肽增加,发酵产物中可溶性氮含量增大。当接种量10%时,纳豆激酶活力和可溶性氮含量均降低。这可能与接种的纳豆菌数量大、消耗的营养物质过多,导致纳豆菌的生长受到抑制。综合评价菌液量对发酵的影响,选择6%～10%接种量作为正交实验水平范围。

图4 接种量对发酵效果的影响Fig.4 Effect of bacterial suspension volume on fermentation results

2.3.3 发酵时间对发酵效果的影响 图5为发酵时间对发酵效果的影响。可见在12～36 h范围内,纳豆激酶的活性是先增加后减少,24 h时纳豆激酶活力最大;可溶性氮含量呈现出先增加后减少的趋势。在固态发酵初期,菌种生长繁殖旺盛,产生各种酶量增多,将发酵底物的大分子有机物水解为小分子物质,有利于肽的生成,则发酵产物中可溶性氮含量高。随着发酵时间的延长,菌种生长进入稳定期,产生的酶量减少,此外,纳豆菌在生长过程中要消耗营养物质,导致可溶性氮含量减少。综合评价发酵时间的影响,确定18～30 h作为正交实验发酵时间范围。

图5 发酵时间对发酵效果的影响Fig.5 Effect of fermentation time on fermentation results

2.3.4 料液比对发酵效果的影响 由图6可知,最适料液比为1∶0.5。固态发酵水分含量过低,影响营养基质的溶解和传递以及颗粒的润胀等条件,不利于菌种生长。水分含量过高不利于通气,使基质成团,影响氧的传递和发酵热的散失。且纳豆芽孢杆菌产生的蛋白酶被稀释,使蛋白酶与底物蛋白接触机率下降,影响水解速率,发酵液中可溶性氮含量少,纳豆激酶的活力较低。综合评价料液比对发酵的影响,确定1∶0.4～1∶0.6作为正交实验水平范围。

图6 料液比对发酵效果的影响Fig.6 Efect of solid-to-liquid ratio on fermentation results

2.3.5 营养盐对发酵效果的影响 添加营养盐的E1组纳豆激酶活力和可溶性氮含量分别为2680 U/mL、5.1 mg/mL;不添加的E2组分别为2260 U/mL、4.6 mg/mL。E1组明显高于E2组,可能于无机盐能作为生长因子促进微生物生长和代谢产物产生有关。综合评价无机盐对两个指标的影响,确定发酵培养基中添加营养盐。

2.4 正交实验结果

L9(34)正交实验结果见表2。

表2 正交实验设计与极差分析结果
Table 2 Orthogonal experiment design and range analysis results

实验号因素A温度(℃)B时间(h)C接种量(%)D料液比(g/mL)纳豆激酶活力(U/mL)11111125921222223031333251242123794522313162623122237731321250832131479933211995K12000333110100016583332138667K22064333229033316730001905667K31574667224800023080001595000R4896661189333649667543667

由正交实验结果可以看出,各因素的主次顺序为:B>C>D>A,即发酵时间对发酵产物中纳豆激酶活力的影响最大,其余依次为接种量、料液比、温度。理论最优组合为A2B2C3D1,即发酵时间24 h、发酵温度37 ℃、接种量10%、料液比1∶0.4 g/mL,与第五组实验结果相吻合。该组的可溶性氮含量为5.6 mg/mL,羟自由基清除率为74%,铁还原力OD值为0.906。

3 结论

本实验运用单因素和正交实验方法对固态发酵花生粕制备纳豆激酶的工艺条件进行优化。其最佳制备工艺条件为:37 ℃下发酵24 h,接种量10%,料液比1∶0.4 g/mL。在此发酵条件下测得发酵液的纳豆激酶活力达到3162 U/mL,比单因素中的最高酶活提高了18%(2680 U/mL),可溶性氮含量为5.6 mg/mL,羟自由基清除率为74%,铁还原力OD值为0.906。

以花生粕作为主要原料进行固态发酵获得具有较高纳豆激酶活性的产品,降低了溶栓激酶的生产成本,为广大心脑血管疾病患者带来福音,而且增加了花生粕的附加值,经济优势明显,对于我国花生产业的发展与农民的增收致富有着重大的意义。

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Optimization of fermentation conditions for nattokinase production in solid-state fermentation by Bacillus subtilis natto using peanut meal as substrate

WANG Yan-ping,HU Ying-fen*,WEI Yu-xi,ZHANG Yuan-jie,LIU Qing

(College of Life Science,Qingdao University,Qingdao 266071,China)

The peanut meal was fermented byBacillusnattoto prepare nattokinase. The technological conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments with a primary indicator of nattokinase. The results showed that the optimal conditions were as follows:fermentation temperature 37 ℃,inoculum size 10%,the ratio of solid/liquid 1∶0.4 g/mL,fermentation time 24 h. Under the optimized conditions,the activity of nattokinase reached 3162 U/mL,18%higher than that obtained in one-factor-at-a-time experiments(only 2680 U/mL). And soluble nitrogen reached 5.6 mg/mL. Hydroxyl free radicals scavenging activity of fermentation broth was 74%,and the required absorbance for determining iron reduction capacities was 0.906.

peanut meal;Bacillusnatto;nattokinase;solid state fermentation

2016-05-10

王艳平(1991-),女,硕士研究生,研究方向：营养与疾病,E-mail:wyp910406@126.com。

*通讯作者:胡迎芬(1962-),女，博士,教授,硕士研究生导师,主要从事天然产物的开发利用及功能性研究,E-mail:qingdahyf2006@163.com。

山东省科技发展规划项目(2014GSF120011)。

TS229

A

1002-0306(2016)23-0161-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.022