铅和镉对牦牛肾脏细胞的影响

刘祥军,孙万成

(青海大学农牧学院,动物科学系,青海西宁 810016)



铅和镉对牦牛肾脏细胞的影响

刘祥军,孙万成*

(青海大学农牧学院,动物科学系,青海西宁 810016)

为了揭示牦牛肾脏细胞在重金属胁迫下的毒理性影响,在培养出的肾脏细胞中加入不同浓度的重金属离子铅(Pb2+)和镉(Cd2+),提取总RNA,在逆转录酶的作用下生成cDNA,利用实时荧光定量技术检测牦牛肾脏细胞中金属硫蛋白mRNA的相对表达量。结果显示,将牦牛肾脏细胞中加入重金属浓度为0 μmol/L的值设定为对照组,2-ΔΔCt值设为1时,加入重金属铅的不同浓度0、5、10、20、30 μmol/L 的样品相对定量五种不同浓度的样品的2-ΔΔCt分别为0.489、0.603、0.796、3.031;添加镉的五种不同浓度的样品的2-ΔΔCt分别为5.280、3.530、8.110、11.630。通过差异性显著分析得出当重金属离子铅(Pb2+)和镉(Cd2+)添加10 μmol/L时对肾脏细胞的生长有明显的抑制作用,相应的金属硫蛋白mRNA表达量较高,通过mRNA相对表达量的比较得出重金属镉的毒性比铅强,当重金属的添加量比较低时,重金属离子通过结合MT降低对肾脏细胞的毒害作用。

金属硫蛋白,牦牛肾脏细胞,重金属

牦牛是高寒地区的特有牛种,草食性反刍性动物,青藏高原主要的畜牧资源,青海省是我国牦牛的主要产区。有“高原之舟”的牦牛对高海拔寒冷的青藏高原比其他物种有着更明显的生存优势,还为牧民提供大量奶源、肉源,更多的劳动力资源[1]。牧民们对牦牛肉制品具有很强的依赖,随着国家对西部大开发的支持,矿业的发展,部分地区难免暴露在重金属污染的环境中,间接的就增加了牧民们重金属中毒的风险。重金属很难被一般的方法降解或者利用,并有相当强的富集作用,毒害人体健康,其中给人们带来最大困扰的有汞、镉、铅等强致病的重金属离子[2-4]。当这些重金属浓度富集到了某种生物体自身能够承受限度的时候,生物体的生长就会出现不适,产生病变,严重影响生物体的生命活动,甚至会导致死亡[5]。根据国际肿瘤研究机构(IARC)的研究,把镉划为I类致癌物[6],还有研究表明镉致癌机理是受到激活的原癌基因影响[7],美国毒物与疾病登记署(ATSDR)和美国环境保护署(USEPA)把镉定为20种最具毒性物质中的一种物质[8]。镉进入组织以后与巯基结合影响组织代谢,或者代替某些金属离子参与组织代谢从而使得组织的某些功能丧失或者改变,影响细胞的生长[9];铅的强毒性表现为对抗氧化酶系统的抑制[10]。单一的重金属具有强毒性,环境中的毒性往往是多种金属相互作用的结果,重金属两两的混合毒性常表现为协同作用[11],房燕[12]等研究表明镉和汞复合组DNA损伤大于汞胁迫组。

金属硫蛋白(metallothionein简称MT),分子量低,对多种重金属有较高的亲和性,每个MT分子可以结合7～12个金属离子[13]的蛋白质。最早是由Margoshes和Valee发现并分离出来的[14]。MT存在范围较广,在低等微生物、植物中均发现了MT[15],李令媛等在大鲵[16]、刺猬[14]中也分离得到MT。MT普遍存在于各种生物体中[18-19],其中以肝脏和肾脏中含量最为丰富,它能广泛地被重金属、激素、以及其他环境因素诱导表达合成[18]。MT在清除自由基的同时还影响细胞代谢、解除重金属的毒性[20],对神经敏感性的也有一定的改善[21],延长人的寿命[22]。环境中广泛存在的金属硫蛋白,以及其能与多种重金属完美的结合的特性,就能够通过检测MT的含量实时对饮食、环境做出监测,所以MT常被用作环境监测中重金属暴露的生物标记物[23]。

金属硫蛋白的检测方法已经很成熟了,酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、DTNB比色法[24]、氨基酸分析法[25]、毛细管电泳法[26]、石墨炉原子吸收光谱法[27],论文的主要内容是研究重金属镉、铅对牦牛肾脏细胞的影响,采集牦牛的肾脏组织进行细胞培养,待组织周围长出新细胞(培养时间为一个月)后,通过添加不同浓度、不同品种的重金属进行测定,以寻找重金属与金属硫蛋白mRNA的对应关系,反之可以通过检测金属硫蛋白mRNA的表达量,来检测重金属含量,预测环境中的重金属含量[28],起到环境安全的预警作用,为食品安全评价提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛肾脏组织 果洛县采集屠宰后(采集样品使用的手术刀、剪刀、镊子等都经过180 ℃,3 h灭菌处理),保存在生理盐水中,置于冰盒中备用。

DMEM高糖培养基、青霉素-链霉素、胰蛋白消化酶、小牛血清、PBS缓冲液、移液枪和微量吸头、细胞培养瓶(25 cm2)、核酸染料(4s Red Plus Nucleic Acid Stain) 上海生物工程技术股份有限公司;RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、琼脂糖、荧光定量染料(SYBR Green II) 宝生物工程有限公司;DHG-9070A电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;2-16KL冷冻离心机 德国SiGMA公司;GeneAMP PCR System 9700 PCR仪 美国ABI公司;JY600电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司;WD-9413A凝胶成像分析仪 北京市六一仪器厂;CFX96荧光定量仪 美国BIO-RAD公司;牦牛MT基因cDNA合成的引物 上海生物工程技术股份有限公司设计合成。

表1 牦牛MT基因cDNA克隆引物
Table 1 cDNA primer of yak metallothionein gene

引物名称引物类型序列信息(5′-3′)MT1FforwardTGCACCGCGGGTGAATCCTGMT1RreverseAGACGCAGCCCTGGGCACACTTβ-actinFforwardGAGGCTCAGAGCAAGAGAGGCβ-actinRreverseCGTTGTAGAAGGTGTGGTGCC

1.2 实验方法

1.2.1 牦牛肾脏细胞培养 牛肾脏组织于灭菌消毒的培养皿中,加入5 mL生理盐水,清洗血迹污垢;加入2 mL生理盐水,冲洗组织3次;向培养皿中加入2 mL生理盐水,剪取一小块组织;沿培养皿底部将组织剪碎成约1 mm3[29]的小块;静置片刻弃掉培养皿上层澄清液体,继续向培养皿中添加2 mL生理盐水,冲洗组织小块3次;用DMEM培养液冲洗剪碎后的组织小块,轻轻吹打3～5次,吸出并移入无菌培养瓶中;将将培养瓶放于超净工作台内,放置2～4 h后,添加17 mL的含小牛血清的DMEM培养基于各培养瓶中,隔天换培养基[30]。培养条件[31]:将经过上述处理好的培养瓶置于CO2培养箱中,培养温度37 ℃,CO2的浓度为5%,培养时间设定为1个月。每天用荧光倒置显微镜观察各组培养瓶中的组织生长状况。

1.2.2 牦牛肾脏细胞中加入不同浓度重金属铅与镉溶液 实验前配置重金属铅(Pb2+)标准溶液浓度为0.00011 μmol/L,重金属镉(Cd2+)标准溶液的浓度为0.00015 μmol/L,培养液总体积为10 mL(根据培养瓶定),添加不同体积的标准溶液,以达到实验要求的不同浓度的培养液,在培养液中加入重金属离子12 h后提取RNA。

表2 重金属离子铅培养液的配制
Table 2 The nutrientsolution of heavy metal lead

浓度(μmol/L)加入重金属铅溶液体积V1(mL)培养液体积V2(mL)00010050595100991201882302773

表3 重金属镉培养液的配制
Table 3 Thenutrientsolution of heavy metal cadmium

浓度(μmol/L)加入重金属镉溶液体积V1(mL)培养液体积V2(mL)00010050397100793201387302080

1.2.3 牦牛肾脏细胞总RNA的提取 将培养瓶中培养液倒出,使用PBS清洗3次;向瓶中加入2 mL胰消化酶,37 ℃水浴3 min,离心弃上清液,向离心管中加入350 μL Buffer RL;吸取裂解液到新的1.5 mL RNase Free Tube中;向上述离心管中加入与液体等体积70%的乙醇,将溶液混均匀,立即将混合液全部转入到RNA Spin Column,12000 r/min,离心1 min,弃废液;加入500 μL的Buffer RWA,12000 r/min离心30 s,弃废液;加入600 μL的Buffer RWB,12000 r/min离心30s,弃废液;将RNA Spin Column重新安置于2 mL Collection Tube上,12000 r/min离心2 min弃废液;加入70 μL的RNase Free dH2O,静置5 min;12000 r/min离心2 min洗脱RNA,保存于-80 ℃保存。

1.2.4 电泳 称取琼脂糖0.2 g,1xTAE 20 mL,添加1 μL核酸染料,配置成1%的琼脂糖凝胶,110 V,30 min条件下进行电泳,并在电泳凝胶成像仪上拍照检测RNA的完整性。

1.2.5 牦牛肾脏细胞金属硫蛋白cDNA的合成 牦牛肾脏细胞中提取的Total RNA为模板,按试剂盒推荐方法进行操作,按37 ℃ 15 min,85 ℃ 5s条件下反转录,反转录得到的cDNA是双链结构,性质比较稳定,可以在4 ℃的条件下保存较长的时间。

表4 PCR反应液
Table 4 The PCR reaction solution

试剂使用量(μL)5×PrimeScriptBuffer(forRealTime)4PrimeScriptRTEnzymeMixI1OligodTPrimer(50μmol/L)1Random6mers(100μmol/L)1TotalRNA2RNasefreewater11

1.2.6 金属硫蛋白实时定量PCR 以合成的cDNA为模板荧光定量,条件:95 ℃ 30 s 1个循环;95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s,39个循环;荧光定量时,除了加入引物MT1F-MT1R做实时定量PCR外,还必须做内参β-actinF-β-actinR的实时定量PCR。

表5 荧光定量反应液
Table 5 RealtimePCR reaction solution

试剂使用量(μL)模板DNA2上游引物(10～20pmol)1下游引物(10～20pmol)1荧光酶12.5Total25

2 结果和分析

2.1 细胞处理前后结果

图1在10倍倒置荧光显微镜下观察到:图A为加入重金属离子之前的细胞形状呈椭圆形,细胞完整,培养液澄清透明,细胞没有发生死亡;图B为加入浓度20 μmol/L重金属镉(Cd2+)之后的细胞,细胞的形状呈现不规则的多边形,培养液变浑浊,一些细胞呈现亮斑,表明细胞已经发生死亡。

图1 加入重金属镉离子前后的牦牛肾脏细胞Fig.1 The difference of yak cells in the kidney after added Cadmium

2.2 提取RNA的检测

图2中A图是RNA电泳凝胶图,图中28 s条带亮度是18 s条带的2倍,而28 s的条带亮度较低,RNA有所降解。B图为RNA反转录合成的cDNA电泳凝胶图,图中MT的cDNA长度在100～250 bp之间满足扩增目的DNA的长度,获得约150 bp的DNA片段[32]。

图2 电泳结果图Fig.2 Electrophoresis results注：A：1～6分别表示0、5、10、20、30、30 μmol/L,B图同。

2.3 金属硫蛋白PCR荧光定量

表6 重金属铅胁迫细胞的荧光定量PCR
Table 6 The realtime PCR of yak cell under heavy metal lead stress

铅的浓度(μmol/L)牦牛金属硫蛋白引物反应Ct值内参β-actin反应Ct值Cq1Cq2Cq3平均CqCq1Cq2Cq3平均CqΔct平均值029382944295729462053203221052063029662908291329292190202321872133839028172880285328501998201220232011529392913298429451886187719281897527502713275727401909198719571951942528662846278028311883178918541842102799272628012775180917981831181210264326532683265918431821180718239121027872628272427131788173418021775202441240925152455157015511603155820241424092408241015231655155415778722024722501251224951621160216031609302479248725082491173617341765174530276127512741275121642212217421836793026642721256426491904198718891927

表7 重金属镉胁迫细胞的荧光定量PCR
Table 7 The realtime PCR of yak cell under heavy metal cadmium stress

镉的浓度(μmol/L)牦牛金属硫蛋白引物反应Ct值内参β-actin反应Ct值Cq1Cq2Cq3平均CqCq1Cq2Cq3平均CqΔct平均值028472964292929132123209020992104027722743273827512118210920782102655026132622261826182089205621882111521722143213821511832181018081849522232275223522681875185318211829415523152289230723041789180118121801102238225722422246174917931810178410223423072301228117561788179717804731023122252226222751801182118341819202141211021962149175717331733174120211421752123213717681741173117473532021982003206120871801181117891800302387237823902385208821162091209830228623292316231019561947191619273013022782362231523182018208921172075

以浓度0 μmol/L的样品为对照样品,将对照组的2-ΔΔCt值设为1进行阈值比较,通过比较阈值法(2-ΔΔCt)进行相对定量[33],根据公式:2ΔΔCt=2-[(实验组MT Ct-实验组β-ACTIN Ct)-(对照组MT Ct-对照组β-ACTIN Ct)],将对照组(0 μmol/L)的2-ΔΔCt设定为1,计算得到重金属铅的五种不同浓度的样品2-ΔΔCt的分别为0.489、0.603、0.796、3.031;重金属镉的五种不同浓度的样品的2-ΔΔCt分别为5.280、3.530、8.110、11.630。

图3 MT mRNA相对定量拷贝数Fig.3 MT mRNA relative quantitative copy number

图3为MT mRNA相对定量的拷贝数,从图中可以看出,加入相同浓度的重金属镉比重金属铅的MT mRNA相对定量的拷贝数要高,根据测定的Ct值,还可以看出加入重金属的浓度越高MT mRNA相对定量的拷贝就越高,牦牛肾脏细胞中加入重金属镉的金属硫蛋白mRNA表达量相对较高,重金属铅的MT mRNA表达量较低,总体来说重金属的浓度越高,MT mRNA相对定量值就越大。

根据测定的Ct值,利用SPASS17.0分析软件计算得出重金属铅的不同浓度之间金属硫蛋白含量的差异显著性如表8、表9。

由表8可以看出铅的不同浓度之间MT含量差异显著性,浓度为0 μmol/L和5 μmol/L之间差异不显著,0、10、20、30 μmol/L之间MT含量差异显著。

由表9可以看出镉的不同浓度之间MT含量差异显著性,浓度为0 μmol/L和5 μmol/L之间差异显著,与10、30 μmol/L之间MT含量差异显著,与20 μmol/L差异不显著可能是因为与mRNA的降解有关。

表8 铅的不同浓度之间MT含量差异显著性分析表
Table 8 Significant differenceanalysis of MT contentin different concentrations of lead

不同浓度(μmol/L)05102030300027∗0021∗00850018∗1000200045∗0038∗0026∗1000100019∗0012∗100050679100001000

注：*表示两样品之间的MT含量差异显著p<0.05。

表9 镉的不同浓度之间MT含量差异显著性分析表
Table 9 Significant differenceanalysis of MT contentindifferent concentrations of cadmium

不同浓度(μmol/L)05102030300042∗0011∗00070021∗10002000630011∗0014∗1000100049∗0034∗100050053∗100001000

注：*表示两样品之间的MT含量差异显著p<0.05。

3 结论

根据2-ΔΔCt比较法,将浓度为0 μmol/L的样品的2-ΔΔCt设定为1,加入不同浓度重金属铅的样品得到2-ΔΔCt的分别为0.489、0.603、0.796、3.031;加入不同浓度重金属镉的样品的2-ΔΔCt分别为5.280、3.530、8.110、11.630;当镉(Cd2+)添加5 μmol/L时肾脏细胞中MT有明显的产生，当铅(Pb2+)添加量10 μmol/L时 ,肾脏细胞中MT有较为明显的产生；由mRNA相对表达量可知,重金属镉和铅可以促使金属硫蛋白mRNA的表达,并且随着重金属浓度的增加mRNA的表达量就相应的增加。

综上所述重金属镉和铅可使肾脏细胞生成大量的金属硫蛋白mRNA,螯合生成金属硫蛋白的含量就越多,超过某种细胞的耐受限度,细胞就会发生死亡[5],表明能通过与MT的结合可以有效的减轻重金属对机体的毒害。重金属浓度高,MT含量就越高,通过金属硫蛋白的mRNA表达量比较,可以反映出牦牛体内的重金属含量,预测环境中的重金属污染程度,起到环境安全的预警作用,同时也可以为食品安全提供数据支持。

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Effects of lead and cadmium on yak kidney cells

LIU Xiang-jun,SUN Wan-cheng*

(Department of Animal Science,College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining 810016 China)

In order to reveal the yak kidney cells’poison rational influence under the stress of heavy metal,in the produce of kidney cells with different concentrations of heavy metal ions of lead(Pb2+)and cadmium(Cd2+),metallothionein mRNA expression of yak kidney cells were detected by Real-time PCR. It showed that the value of sample after added five different concentrations of heavy metal lead were 0.489,0.603,0.796,3.031 and the value of sample of the five different concentrations of heavy metal cadmium were 5.28,3.53,8.11,11.63,respectively,when adding different concentrations of heavy metal 0,5,10,20,30 μmol/L into the yak kidneycells. The result showed that it had obvious inhibitory effect on growth when added 10 μmol/L Pb2+and Cd2+into the kidney cells,and the corresponding amount of mRNA expression of metallothionein was relatively high,and the toxicity of heavy metal Cd2+was stronger than Pb2+comparing to the relative expression of mRNA,and the toxicity of cells was reduced by combining MT when heavy metal content was relatively low.

matallothionein;Yak kidney cells;heavy meta

2016-07-11

刘祥军(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：反刍动物营养与生产，E-mail：1102961429@qq.com。

*通讯作者:孙万成(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品质量与安全，E-mail：sun.wancheng0108@aliyun.com。

国家自然基金项目(31160215)。

TS251.7

A

1002-0306(2016)23-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.016