利用微卫星标记高效鉴定松浦镜鲤的亲缘关系

胡雪松，葛彦龙，李池陶，王世会，贾智英，张秋军，石连玉

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

利用微卫星标记高效鉴定松浦镜鲤的亲缘关系

胡雪松，葛彦龙，李池陶，王世会，贾智英，张秋军，石连玉

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

用37尾雌和14尾雄松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu构建37个血统明确的全同胞家系，同池、同条件养殖。用筛选出的9个多态性微卫星标记和建立的多重PCR检测方法进行子代群体（1 318尾）的亲权鉴定。9个位点共检测到53个等位基因，各位点均为高度多态（PIC＞0.5），平均期望杂合度为0.742，观测杂合度为0.755。亲本基因型信息的模拟分析显示，利用9个标记将子代分配到亲本对的成功率可达100%。实际鉴定结果：1 287尾个体准确鉴定到配组的亲本对，鉴定成功率为97.6%。以上结果表明：本研究提供的标记和检测方法可用于松浦镜鲤的亲本遗传距离分析和家系亲缘追溯，也适用于群体遗传多样性监测。

松浦镜鲤；微卫星；家系；亲缘关系

微卫星标记在基因组中广泛分布，具有丰富的多态性且按孟德尔方式共显性遗传，比传统的同工酶或其他标记更能反映近缘个体间的遗传差异[1-3]，已成为水产动物遗传学相关研究中应用最广泛的分子标记[4-6]，其应用范围包括群体遗传结构分析[7-9]、基因图谱构建[10-14]及亲缘关系鉴定等[15-17]。

鱼类特殊的生活环境和繁殖方式容易发生系谱混乱，导致优良生产性状或适应性逐代下降。鉴定亲本的亲缘关系可提供配组依据，降低近交几率。和畜禽等养殖动物相比，鱼类出生时个体较小，难以利用物理标记进行早期个体区分。在家系选育或遗传参数评估时，为剔除环境因素的非遗传性效应，很多研究将不同家系来源的受精卵混合孵化，或将初孵仔鱼在相同条件下混合养殖，再利用微卫星标记鉴定家系来源[18-20]。鉴定亲缘关系的前提是需要有足够多的多态性丰富的微卫星标记位点。为使外形和目标性状趋于稳定，鱼类新品种培育须经多世代的高强度选择，等位基因可能会较大程度地丢失。在此情况下，属间甚至种间的微卫星引物会失去通用性，因此筛选特定品种的分子标记十分必要。

松浦镜鲤是黑龙江水产研究所于2008年在德国镜鲤选育系（F4）的基础上培育出的鲤新品种，是水产原良种委员会的登记品种（GS01-001-2008）。该品种鳞少易加工，其生长速度和出肉率远高于其他鲤品种，且目前已被推广到全国20多个省市养殖，带来了巨大的经济和社会效益。然而，目前尚未开发出适合松浦镜鲤亲缘关系鉴定的分子标记。本研究通过构建已知亲本对的松浦镜鲤家系，从中筛选出9个高度多态微卫星位点，建立各位点基因型的快速检测方法用于亲缘关系鉴定，旨在为指导该品种亲鱼的科学配组或辅助制定家系选育计划提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 家系构建

实验用松浦镜鲤（SJ）来自黑龙江水产研究所呼兰实验中心。于2013年，挑选健康雄性亲鱼14尾和雌性37尾，以不平衡的巢氏交配的方法配组，每尾雄鱼与2、3尾雌鱼交配，利用人工授精建立37个全同胞家系。配组时收集亲鱼鳍条样本，将带有不同组合编号的受精卵单独孵化。孵化后的子代个体始终同池、同条件养殖，生长至60d时，采集所有子代个体（1 318尾）的鳍条用于亲缘关系鉴定。

1.2 DNA提取

采用酚氯仿法提取所有亲本和子代样本鳍条基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和浓度。DNA原液稀释至200ng/μL，置 -20℃保存，DNA工作液稀释至50ng/μL，置4℃备用。

1.3 引物筛选和PCR扩增

实验选用部分在德国镜鲤选育系F4（JL）中扩增效果较高的MFW系列引物（MFW1、MFW5、MFW7、MFW11），参考Crooijmans等[21]报道的序列合成。另外9对引物均来自本实验室开发的HLJ系列，筛选自鲤新一代连锁图谱[10]，相关信息见表1。PCR扩增体系共20μL，包括ddH2O 13.7μL、10× PCR buffer 2μL、1.5mM MgCl21.6μL、10mM dNTPs 2μL、10μM上下游引物各0.6μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.08μL，及50ng/μLDNA模板1μL。PCR反应条件为：94℃变性4min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸5min，4℃保温。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。利用银染法显带并拍照，用Gel-pro analyzer软件确定等位基因大小。进一步进行4个多重PCR反应，分别包含以下引 物 组 合 ：1（HLJ1115、HLJ3656、HLJ3526）、2（HLJ3473、HLJ3850）、3（HLJ3857、HLJ3993）、4（HLJ3 938、HLJ3948），PCR反应体系均为20μL，体系仅ddH2O作相应改变，其余各成分体积均与单引物PCR反应相同。反应退火温度分别为55℃、57℃、55℃和58℃，其他反应条件及PCR产物的聚丙烯酰胺电泳检测和显带方法与单引物PCR反应相同。将基因型数据整理成0、1矩阵。

表1 松浦镜鲤家系鉴定的微卫星标记引物信息Tab.1 Microsatellite primers information on family identification of Songpu mirror carp

1.4 遗传参数统计和家系分配计算

利用实验室自编软件将包含亲本和子代的0、1矩阵基因型文件转换成Genepop格式文件。利用Cervus3.0软件统计等位基因数，计算多态信息含量、期望杂合度和观测杂合度等遗传参数。基于亲本的基因频率，运行模拟分析模块（已知亲本性别父母对）分析，置信概率为95%，子代样本数为1 500，候选父本为14，母本为37。同时基于各家系（子代）群体的基因频率，计算累积排除率，综合判断各位点的鉴定能力。最后利用家系分析模块（已知亲本性别父母对）计算出候选父母的LOD值，LOD值越大代表可信度越高，如将子代个体分配到组建的家系视为鉴定成功。

1.5 遗传距离分析

利用PopGen32软件计算家系（子代）间各组合及各家系亲本组合间的Nei氏遗传距离。

2 结果与分析

2.1 微卫星引物扩增效果检测

选择在JL扩增效果理想的MFW系列引物扩增SJ DNA样本进行扩增，效果不理想。不同微卫星位点在JL中表现为高度多态[22]，但在本次SJ中检测到的等位基因数和基因型均较少（表2），未在后续研究中应用。

表2 MFW系列引物在JL和SJ中扩增的等位基因数比较Tab.2 Comparison of allele number（Na）amplified in JL and SJ by primers from the MFW series

已筛选出的9对HLJ系列引物扩增SJ DNA样本，各位点扩增和分型效果均较理想，适合SJ家系鉴定。各位点的聚丙烯酰胺检测结果见图1。不同位点组合后，其多重PCR产物的聚丙烯酰胺检测结果见图2。

图1 松浦镜鲤在9个微卫星位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱Fig.1 The polyacrylamide gel electrophoresis results at 9 microsatellite loci in Songpu mirror carp

图2 松浦镜鲤在9个位点的多重PRC扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱Fig.2 The polyacrylamide gel electrophoresis results of multiple PCR at 9 microsatellite loci in Songpu mirror carp

2.2 遗传变异参数和家系鉴定

9个微卫星位点共检测到53个等位基因，平均每个位点为5.89个。平均期望杂合度和观测杂合度分别为0.742和0.755，所有位点均为高度多态（PIC＞0.5）（表3）。模拟分析显示，利用9个位点将任意已知基因型的子代样本鉴定到父本的概率为82%，而鉴定到母本的概率仅为40%，鉴定到父母对的概率为100%（图3）。利用各位点的基因频率计算累积排除率，随位点数目的增加，累积排除率增大（图4）。在父母基因型未知的情况下，9个位点的累积排除概率为0.99046；在已知一个亲本基因型时，累积排除另一个亲本的概率为0.99948；累积排除亲本对的概率为0.99997。对同一家系的随机个体而言，累积排除概率为0.99754。在1 318尾个体中，有31尾鉴定到多个亲本对，其余1 287尾个体准确鉴定到36个家系，鉴定率为97.6%。

表3 9个微卫星标记在松浦镜鲤家系中的遗传参数分析Tab.3 Genetic parameters analysis of families in Songpu mirror carp by 9 microsatellite markers

图3 利用9个微卫星位点预测松浦镜鲤母本、父本和亲本对的成功率Fig.3 Predicted assignment success rate of Songpu mirror carp for mother alone,father alone and parent pair using nine microsatellite loci

图4 基于基因频率计算微卫星位点数与累积排除概率之间的关系Fig.4 Relationship between number of microsatellite loci and combined exclusion probability based on gene frequency

2.3 遗传距离

遗传距离计算结果显示，各家系亲本间的遗传距离范围为0.285～0.762（图5），而各家系（子代）间组合的遗传距离范围很小，平均仅为0.029，最大为0.133（图6）。

图5 各家系亲本间的遗传距离Fig.5 Genetic distances between parents of each family

图6 各家系（子代）间遗传距离Fig.6 Genetic distances between each family（offspring）

3 讨论

经过多代强化选育后，松浦镜鲤表型（体型、鳞被）特征的遗传一致性较选育前更高。多个在德国镜鲤选育系（F4）或其他鲤品种中具有丰富多态性的微卫星座位在松浦镜鲤中已纯合或多态性较低，不宜于在家系鉴定中应用。这充分表明该品种选择强度较高，其基因库整体遗传多样性下降。本研究获得9个具有高度多态性的微卫星位点，平均等位基因数为4～7个，远低于在3个德国镜鲤选育系（F4）群体中检测到的结果（14.4个）。相比较而言，虽然检测位点的平均杂合度较高，但不代表群体有相应的多样性水平。

在利用分子标记鉴定亲缘关系前，需先进行模拟分析，初步确定标记的检测效率和合理的标记数目。当鉴定的家系较多或亲本基因型信息不清时，应有足够多的标记才能准确区分亲本来源。模拟分析显示，利用7个高度多态标记（PIC＞0.7）将斑节对虾Penaeus monodon的子代准确匹配到30个家系的成功率低于80%；当设定为13个家系时，能正确匹配的比率达到96%[23]。该结果与本研究相似，当松浦镜鲤设定为36个家系时，利用7个标记成功鉴定父母对的比率为76%，而当标记数增加到9个时，成功率达到100%。进一步利用基因频率计算累积排除率，在亲本性别已知时，9个标记的累积排除概率可达到0.99997。以上结果是利用9个标记进行亲本来源鉴定的依据。实际鉴定结果与模拟分析相符，97.6%子代个体成功分配到配组家系，其中2.4%的个体分配到多个家系，这可能是基因型误判所致。

本研究在家系建立前未进行亲本亲缘关系的测算，利用筛选出的标记计算出的各家系亲本间的遗传距离为0.285～0.762。根据孙效文等[24]在德国镜鲤选育系（F4）中的研究结果，亲本遗传距离的可选范围是0.2～0.7，因此松浦镜鲤亲本间存在较大的配组选择空间。另一方面，36个子代家系间的遗传距离范围很小，仅为0.029～0.133，这可能与松浦镜鲤较高的选育强度有关。

综合本研究结果可知，经过多代的强化培育，松浦镜鲤不仅表型（形态、鳞被等）具有很强的一致性，群体的基因型一致性水平也有较大提高。本研究筛选出的9个多态性分子标记和检测方法可用于监测不同地区或来源的松浦镜鲤群体遗传多样性的动态变化。在该品种未来的选育实践中，可用这些标记和检测方法建立核心群的系谱档案追溯混养子代的亲本来源。

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［24］孙效文.鱼类分子育种学［M］.北京:海洋出版社,2010.

Highly Effective Identification of Genetic Relationship of Songpu Mirror Carp（Cyprinus carpio Songpu）Using Microsatellite Markers

HU Xue-song,GE Yan-long,LI Chi-tao,WANG Shi-hui,JIA Zhi-ying,ZHANG Qiu-jun,SHI Lian-yu
（National and Local United Engineering Laboratory for Freshwater fish Breeding,Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

In the present study,37 females and 14 males of Songpu mirror carp（Cyprinus carpio Songpu）were used to establish 37 full-sib families with clear genealogy,and all offspring individuals were cultured in a same pond and under the same conditions.Nine polymorphic microsatellite markers were chosen,and a multiple PCR detection method was furtherly used for the parentage assignment of 1 318 offspring samples.A total of 53 alleles were detected and each locus showed high polymorphism（PIC＞0.5）.The average expected and observed heteroygosity were 0.742 and 0.755,respectively.The simulation analysis based on genotypic information of parents showed that 100%of progeny could be correctly assigned the parent pair using 9 markers.In fact,the assignments to the actual family of 1 287 individuals with 9 loci were completed,and the success rate was 97.6%.All these results suggest that our marker suite can be used for genetic diversity detection,genetic distance analysis and parentage assignment in Songpu mirror carp.

Songpu mirror carp;microsatellite;family;genetic relationship

S917

A

1005-3832（2016）05-0037-06

2016-05-26

中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目（HSY201302）；现代农业产业技术体系建设专项（CARS-46-02）；国家科技支撑计划资助项目（2012BAD26B02；2012BAD26B01）.

胡雪松（1977-），男，博士，从事鱼类生理和育种研究.E-mail:huxuesong@hrfri.ac.cn

石连玉（1960-），男，研究员，从事鱼类遗传育种研究.E-mail:sly2552@yahoo.com.cn