紫外光谱法研究喷昔洛韦与DNA的相互作用

王晓霞，郭贵宝，王正德，马力通，闫 慧，海 波，刘云颖，白宇辰

（内蒙古科技大学化学与化工学院，内蒙古 包头 014010）

研究与开发

紫外光谱法研究喷昔洛韦与DNA的相互作用

王晓霞，郭贵宝，王正德，马力通，闫 慧，海 波，刘云颖，白宇辰

（内蒙古科技大学化学与化工学院，内蒙古 包头 014010）

本文采用紫外光谱法研究了喷昔洛韦与DNA相互作用的光谱特性。结果表明，DNA的加入使喷昔洛韦的紫外光谱产生增色、蓝移的现象；喷昔洛韦与DNA之间的作用主要是嵌插作用，它们之间的结合常数K＝3.14×102L·mol-1。

喷昔洛韦；DNA；紫外吸收光谱

喷昔洛韦(Penciclovir，PCV)，化学名为9-[4-羟基-3-(羟甲基)丁基]鸟嘌呤（图1），是由英国史密斯克莱恩·比彻姆（Smithkline Beecham）公司研究开发的抗病毒药，是抗病毒药法昔洛韦（Famiciclovir,FCV）的活性代谢产物，属于核苷酸类抗病毒药物[1]，于1996 年首次在英国上市[2]。喷昔洛韦属于无环鸟嘌呤衍生物，其结构和活性谱与无环鸟苷相似，但在作用机制方面有某些本质的区别。由于喷昔洛韦的磷酸化率、稳定性、磷酸盐衍生物浓度及对病毒 DNA 多聚酶的亲合力均较无环鸟苷高，故喷昔洛韦在安全性、疗效和给药方法等方面比无环鸟苷有优势。因为喷昔洛韦对疱疹病毒有独特疗效，已成为治疗唇疱疹的首选药物，同时亦是治疗生殖器疱疹的有效药物。对外阴疱疹、带状疱疹、免疫缺陷患者的疱疹感染及乙肝病毒等正在进行临床试验[3]。目前在我国，喷昔洛韦原料药已实现产业化，国内有多家企业正在开发喷昔洛韦的新剂型，重点是开发眼用制剂(治疗病毒性眼角膜炎)、注射剂(治疗带状疱疹、乙型病毒性肝炎和丙型病毒性肝炎)等。

图1 喷昔洛韦的结构式

脱氧核糖核酸(DNA)是重要的生命物质基础与重要的遗传物质,具有储存和传递信息的功能,它控制着蛋白质的合成, 也是许多药物的靶向分子。药物分子与DNA的相互作用会影响到DNA的生理和物理化学性质[4]，改变DNA的转录和复制。目前普遍认为药物分子与DNA的非共价键力作用包括静电结合、沟渠结合和嵌插作用3种方式（图2）[5]：1）静电结合，即带正电荷的小分子与DNA链中磷酸骨架上的负电荷产生静电作用而结合；2）沟槽作用。进入DNA的大小沟中与DNA的某些基团结合；3）嵌插作用。与DNA中的碱基等基团相互作用[6]。

图2 药物分子与DNA相互作用的3种方式

研究小分子药物与核酸的相互作用，对药物的作用机理以及以核酸为靶标的药物分子的设计有一定的意义。在医药研究中，DNA与靶向分子相互作用的研究不仅可以阐述一些抗肿瘤、抗病毒药物以及致癌物的作用机理，而且对进一步指导新型药物的设计合成研究都具有重要意义。本文采用紫外光谱法，对喷昔洛韦与DNA相互作用的光谱性能及作用方式进行研究，以期为理解药物对DNA的影响提供一定的理论依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Specord 50双光束紫外分光光度计，SHA-B恒温振荡器，PHS-25C pH检测计，TP-114型电子天平。

喷昔洛韦（PCV，C10H15N5O3），无水乙醇（分析纯），盐酸（分析纯)，鲑鱼精DNA。

1.2 溶液制备

经计算，称取喷昔洛韦配制为1×10-4mol·L-1的喷昔洛韦乙醇溶液，配置0.21mg·mL-1的DNA工作液。利用PHS-25C pH检测计配制出pH梯度为2.0～9.0的Tris-HCl溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 不同浓度喷昔洛韦溶液与鲑鱼精DNA工作液的相互作用

准备10支10mL干净的刻度管，分别在刻度管中加入1mL的 DNA工作液，然后再向每支刻度管中分别加入不同体积的喷昔洛韦溶液（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mL），最后用二次蒸馏水定容、摇匀。将二次蒸馏水加入比色皿中作为参比，用紫外分光光度计进行测量。不同浓度DNA与喷昔洛韦的相互作用方法同上。

1.3.2 不同反应时间对体系影响

取1支10mL干净的试管，分别加入1mL喷昔洛韦与1mL的DNA工作液，最后用二次蒸馏水定容，摇匀。将二次蒸馏水加入比色皿中作为参比，放置不同时间，用紫外分光光度计进行测量，测出不同反应时间对反应体系的影响。

1.3.3 pH对体系的影响

取9支10mL干净的刻度管，分别加入1mL喷昔洛韦与1mL的DNA工作液，分别加入pH梯度为2.0～9.0的Tris-HCl溶液，最后用二次蒸馏水定容、摇匀。将二次蒸馏水加入比色皿中作为参比，采用紫外分光光度计进行测量。

1.3.4 增大温度对体系的影响

取2支10mL干净的刻度管，分别加入1mL的DNA工作液，然后向每只刻度管中分别加入不同体积的喷昔洛韦溶液（0mL、1mL），最后用二次蒸馏水定容、摇匀。在不同温度的恒温水域中静置0.5h，将二次蒸馏水作为参比，用紫外分光光度计分别进行测量。

2 实验结果与分析

2.1 喷昔洛韦与DNA相互作用的紫外光谱

DNA的最大吸收峰在260nm处，由图3与图4可知，随着喷昔洛韦浓度增加，DNA的紫外吸收光谱最大吸收波长从260nm逐渐向左移至254nm。增色效应和减色效应是与DNA双螺旋结构和空间构型密切相关的特有光谱性质。增色效应是指有机化合物的结构发生变化，而使其吸收带的摩尔吸光系数增加的现象，减色效应是指有机化合物的结构发生变化而使其吸收带的摩尔吸收系数减小的现象[7-9]。发生增色效应时喷昔洛韦与DNA中的碱基基团配位，是DNA双螺旋结构改变的结果。而减色效应是喷昔洛韦与DNA中的磷酸基团静电作用，使DNA发生空间轴向收缩的结果。喷昔洛韦与DNA作用时，结合位点发生一定的竞争作用，发生蓝移现象。而喷昔洛韦在DNA碱基对之间存在插入作用[10]，故显示增色效应。

图3 浓度从0依次增加到0.0945mg·mL-1的DNA工作液与浓度为1×10-4mol·L-1的喷昔洛韦溶液的紫外吸收光谱

图4 浓度从0依次增加到4.5×10-5mol·L-1的喷昔洛韦与0.21mg·mL-1的DNA工作液的紫外吸收光谱

DNA最大吸收值随药物与DNA浓度的比值呈线性关系，说明这两种药物与DNA结合是一配基一受点的结合方式，即药物浓度愈大，DNA的吸附愈强，这反映出DNA长链大分子有较多的结合位点，可以容纳较多的药物小分子。根据双倒数公式[11-12]有：1/(A-A0)=1/A0+1/(K×A0×CDNA)，式中A0、A分别表示加入DNA前后的药物吸收值，K表示结合常数。代入实验结果，经计算DNA与喷昔洛韦相互作用的结合常数K=3.14×102L·mol-1，表明这两种药物在DNA上存在着许多的结合位点。

图5 喷昔洛韦浓度对DNA紫外吸收峰值的影响

图6 不同浓度DNA与喷昔洛韦作用的双倒数曲线

2.2 不同反应时间对体系影响

DNA有两个结合位点, 即碱基和磷酸基团，喷昔洛韦在DNA碱基对中发生插入作用。研究溶液紫外吸收值随时间变化的情况[13]，由图7数据可知，随着混合时间的增大，喷昔洛韦与DNA在不同时间上的紫外吸收光谱的谱线峰值从0.1255上升到0.1729，总体上升了0.0474，即随着反应时间的增加，喷昔洛韦与DNA相互作用的吸收峰值呈上升趋势。由图8可知，紫外光谱一直显示增色效应。实验结果还表明，当反应到达一定时间后，药物与DNA的紫外吸收值趋于稳定状态。通过数据可知，当反应达到一定时间后(约16min左右)，药物与DNA的吸收值呈现出稳定状态，这表明喷昔洛韦与DNA的结合是一个伴随着扩散过程的结合。随着时间的延长，药物与DNA反应的速率逐渐上升直至达到动态平衡[14]。

图7 不同反应时间对体系的影响

图 8 不同反应时间的紫外吸收光谱

2.3 pH对体系的影响

图9为喷昔洛韦与DNA体系在不同pH条件下的紫外吸收曲线。降低酸度可中和掉DNA磷酸基团的负电荷，有利于双螺旋二级结构的稳定性，但当pH低于4.0或者大于11.0时，酸碱可引起DNA碱基之间的氢键变性，致使DNA双螺旋结构发生变化。

图9 pH对体系的影响

由图9可见，当pH值处于2～4时体系紫外吸光度不断变化；当pH值处于6时，紫外吸收值达到最大。如果考虑热运动造成的误差，可以认为当pH值在2～9内，特征峰波长基本在255nm附近，这说明pH值取2～9时，喷昔洛韦与DNA的相互作用相对稳定。因此，在pH变化的情况下紫外光谱的吸收值比较大，且波长向长波方向移动。详细的作用机理比较复杂，还需要进一步的研究。

2.4 温度对喷昔洛韦与DNA相互作用的影响

温度从25℃上升到45℃的过程中，吸光度由0.019上升到0.294，最后在温度到达55℃时略微降低，趋于稳定。而DNA溶液的特征波峰也随温度的升高发生了略微红移。而喷昔洛韦与DNA混合液的紫外吸光度则不断升高。加入药物前后的DNA的紫外吸光度有很大的差别，温度的影响直接导致系统内能增加，促进两种物质的相互作用，所以二者的紫外吸光度有很大变化，而温度的影响又使得单独DNA的特征波峰发生细微变化。

3 总结

喷昔洛韦与DNA的作用方式和程度取决于时间、浓度、酸度和离子强度等因素。喷昔洛韦浓度增加，PCV-DNA紫外光谱呈现出越来越明显的增色效应。经过初步的实验得出，喷昔洛韦通过插入至DNA的碱基而发生蓝移现象。同时，利用双倒数法求得喷昔洛韦与鲑鱼精DNA 结合的结合常数K=3.14×102L·mol-1，表明喷昔洛韦与DNA相互发生作用。实验结果还进一步表明，生物大分子与药物小分子的相互作用受多方面因素的影响，其中药物浓度的影响较为显著，这意味着，在生物分子领域，物质之间的相互作用还是以静电力、范德华力等电磁相互作用为主。

[1] 邓燕，何农跃，张永强，傅娟，张继德.喷昔洛韦的合成工艺研究[J].中国现代应用药学杂志，2009(9)： 737-739.

[2] 邹尚荣，洪鸣.抗病毒药喷昔洛韦的合成工艺改进[J].海峡药学 2009(4)：92-94.

[3] 陈梅玲，裴慧霞.喷昔洛韦合成工艺研究[J]．中国药业，2006(7)：33-34.

[4] 张爱梅，贾丽萍，黄蓬.光谱法研究头孢曲松钠与DNA的相互作用[J].聊城大学学报（自然科学版），2009(1)：51-53.

[5] 刘炜，张琼梅.岩白菜素与DNA相互作用的光谱研究[J].海南师范大学学报（自然科学版），2011(2)：177-179.

[6] 魏光成，付彩霞，闫苗苗.荧光探针辅助研究硒(Ⅱ)、土霉素与DNA的相互作用[J].光谱实验室，2012(2)：865-869.

[7] 彭俊峰，凌建亚，张晗星，张长铠.虫草素与DNA作用的光谱研究[J].光谱学与光谱分析，2004(7)：858-861.

[8] 蔡雪梅，李建晴，王文艳，董川，卫艳丽.光谱法研究R-（+）-萘普生与DNA的相互作用[J].分析科学学报，2011(3)：351-354.

[9] 张婧，胡林，刘艳辉，张碧程.DNA凝聚性质的紫外光谱研究[J].光谱学与光谱分析，2012(5)：1306-1309.

[10] 程风杰，李楠，周瑞河，刘延成，陈振锋，梁宏.喷昔洛韦的晶体结构及其与ct-DNA的相互作用[A].第六届化学生物学学术会议论文集[C]，2009-10-22.

[12] 费丹，王兴明，阮开敏，等.γ-环糊精-达旦黄包合物与鲱鱼精DNA的作用机理[J]．中南大学学报（自然科学版），2009，40(2)：367-374．

[13] 高苏亚，王黎，范涛，等.光度法研究姜黄素金属络合物与鲑鱼精DNA的相互作用[J].应用化工，2010，39(6)：796-799．

[14] 张朝红，苏欣，臧树良，赵广富，冯冲，铁梅，耿兵，董殿波.用紫外光谱和荧光光谱研究三丁基锡化合物与脱氧核糖核酸的相互作用[J].分析科学学报，2006(3)：267-270.

[15] 张碧程，胡林，刘艳辉，张婧.喹诺酮药物与DNA分子相互作用的紫外光谱研究[J].山东大学学报（理学版），2011(7)：11-16.

Interaction of Ultraviolet Spectroscopy Study of Penciclovir and DNA

WANG Xiaoxia, GUO Guibao, WANG Zhengde, MA Litong, YAN Hui, HAI Bo, LIU Yunying, BAI Yuchen
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University of Science and Technology, Baotou 014010, China）

The spectral properties of penciclovir and DNA by UV spectra technique was studied. The results showed that the addition of DNA made the ultraviolet spectrum of penciclovir produce color, blue shift phenomenon. Between the penciclovir and DNA role was the intercalation. The binding constant between them was K=3.14×102L/mol.

penciclovir; DNA; ultraviolet absorption spectra

TQ 463；R 914.5

A

1671-9905(2016)12-0001-04

国家自然科学基金（21463016）；内蒙古自然科学基金(2013MS0209)；内蒙古高等学校科学研究项目(NJZZ14160)；内蒙古科技大学创新基金资助项目（2012NCL034）

王晓霞（1984-），女，内蒙古包头市人，讲师，硕士，主要从事荧光光谱分析，电话：（0472）5951561，传真：（0472）5951561，E-mail:wxx572369@163.com

2016-10-18