不同诱变方法对TL-15028菌株产泰乐菌素相关性能的影响

李春玲，丁亚莲，谢文静，牛春，张萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川，750101)

不同诱变方法对TL-15028菌株产泰乐菌素相关性能的影响

李春玲，丁亚莲，谢文静，牛春，张萍*

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川，750101)

为了选育出泰乐菌素高产菌株，以弗氏链霉菌 (Streptomycesfradiae) TL-15028菌株作为出发菌株，利用化学诱变、物理诱变以及复合诱变的方法对菌株进行诱变处理，比较不同诱变方法的诱变效果，通过诱变筛选出1株遗传稳定性好、且具有泰乐菌素和豆油抗性的菌株TLEU-1503，其发酵效价比出发菌株提高了36.5%，达到14124 μg/mL，对泰乐菌素高效生产、品质提升具有重要意义。

泰乐菌素；高产菌株；复合诱变；选育

泰乐菌素(Tylosin)是一种16元大环内酯类禽畜专用抗生素，主要由弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)产生，可有效抑制革兰氏阳性菌、某些革兰氏阴性球菌、支原体、分枝杆菌、螺旋体及原虫等微生物的生长，对猪流行性肺炎、鸡败血症等多种常见疾病有着独特的疗效[1-3]。同时，泰乐菌素还可以促进禽畜生长，提高饲料利用率，缩短饲养周期，提高经济效益[4]。泰乐菌素高效、低残留、不易产生耐药性，被广泛用作兽药和饲料添加剂，也是国家规划重点发展的兽药产品[5-7]。但是，目前国内泰乐菌素基础与应用研究方面较弱，特别是生产菌种的效价远不及国外水平，严重阻碍了泰乐菌素产量和品质的提升。开展泰乐菌素高产菌株的选育是提高泰乐菌素产量的关键，因此，本研究利用化学诱变、物理诱变及两者结合的方法对菌株进行诱变处理，定向选育出具有泰乐菌素、豆油抗性的高产稳定性菌株，为进一步提高泰乐菌素的产量和品质奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 出发菌为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)TL-15028菌株，由宁夏泰瑞制药有限公司技术中心保存。所用试剂均为国产分析纯，恒温大幅振荡摇床(HQL150C，武汉科学仪器厂)、恒温培养箱(LHP160，江苏杰瑞尔电器有限公司)、分光光度计(BECKMANDU-600)、高效液相色谱系统(Watesr)。

1.2 方法

1.2.1 诱变前准备

1.2.1.1 培养基配制 试管斜面与平皿培养基: 含玉米淀粉，NH4NO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，FeSO4·7H2O，琼脂。种子摇瓶培养基：含豆饼粉，精油，酵母粉，玉米浆，重质CaCO3。发酵摇瓶培养基：含鱼粉，玉米淀粉，精油，甜菜碱盐酸盐，K2HPO4，NiSO4·6H2O，MgSO4·7H2O，轻质CaCO3，KCl，NaCl。pH调至7.2，121℃灭菌15 min，备用。

1.2.1.2 培养条件 在黑暗、温度29 ℃、相对湿度40%条件下培养，试管斜面培养9 d，平皿培养18 d，种子摇瓶转速220 r/min、培养48 h，发酵摇瓶转速220 r/min、培养6 d。

1.2.1.3 菌种复壮 取保藏的斜面试管，倒入6 mL无菌生理盐水，用接种环刮取培养物表面的孢子，使其悬浮，再用脱脂棉过滤，将滤液倒入离心管中，5000 r/min离心2 min，弃上清液，然后加入5 mL生理盐水，用移液器反复吸打沉淀物，倒入三角锥形瓶(型号为100 mL，瓶中装有15粒玻璃珠) 中，再用5 mL生理盐水冲洗离心管2次，一并倒入锥形瓶，29 ℃，220 r/min震荡15 min，过滤得到孢子悬浮液。将孢子悬浮液用稀释至1×10-4，每个平板加入200 μL孢子悬浮液，涂布均匀，培养后挑取单菌落，先进行抑菌圈初筛，然后摇瓶复筛。

1.2.2 诱变方法

1.2.2.1 紫外(UV)诱变处理 参照张明明等[8]的方法，并做了一定改进。诱变处理时间分别为0 s(对照)、15 s、30 s、60 s、90 s。诱变结束后，在黑暗中放置1 h，吸取孢子悬浮液，梯度稀释，涂布平板，在29 ℃培养箱中倒置培养18 d。

1.2.2.2 甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理 参照徐红梅等[9]的方法，并做了一定改进。诱变处理时间分别为1、2、3、4、5 h，吸取诱变后的孢子悬浮液梯度稀释，涂布平板，于29 ℃培养箱倒置培养18 d。

1.2.2.3 LiCl+UV复合诱变处理 吸取5 mL孢子悬浮液置于50 mL三角瓶内，加入1%的 LiCl，放置在摇床间振荡4 h，然后经UV诱变处理60 s，梯度稀释，涂布平板，于29 ℃培养箱倒置培养18 d。

1.2.2.4 EMS+UV复合诱变处理 吸取5 mL孢子悬浮液于50 mL三角瓶中，加入15 μL EMS，放置于29 ℃，220 r/min摇床间震荡4 h，然后经UV诱变处理60 s，梯度稀释，涂布平板，于29 ℃培养箱倒置培养18 d。

1.2.3 性能检测

1.2.3.1 泰乐菌素效价测定 参照Choi等[10]的方法，并做了一定改进。采用HPLC法，色谱柱为ODS柱，流动相为0.85 mol /L氯化钠、40%乙腈溶液，用l mol/L的盐酸调pH至2.5，流速为1 mL/min，检测波长为290 nm；待测效价=(标准品的单位×待测样品的峰面积×待测样品的稀释倍数)/标准品的峰面积。

1.2.3.2 致死率和正突变率 每个处理30皿，重复3次，以未做诱变处理的孢子悬浮液作为对照，致死率=(对照处理平板菌落-诱变处理平板菌落)/对照处理平板菌落×100%。正突变率=诱变处理后效价高于对照5%的菌株数/诱变处理后菌株总数×100%。1.2.3.3 菌株遗传稳定性测定 将高产菌株进行斜面保存，并连续传代 3次，采用摇瓶发酵法测定每一代菌株泰乐菌素效价，分析遗传稳定性。

1.2.3.4 菌株泰乐菌素抗性的检测 孢子悬液稀释后涂布于含有15000 μg/mL泰乐菌素的平板上，于29 ℃培养箱倒置培养18 d，检测菌株的泰乐菌素抗性。

1.2.3.5 菌株豆油抗性的检测 将孢子悬液稀释后涂布于含有4%豆油的平板上，以不含豆油的平板为对照，于29 ℃培养箱倒置培养18 d，检测菌株的豆油抗性。发酵液中豆油残量的测定具体参照徐红梅[9]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 不同诱变方法诱变影响的比较 原始菌株复壮培养后，选取编号TL-15028的菌株为原始出发菌株，分别采用UV、EMS、LiCl+UV、EMS+UV诱变方法进行诱变处理。结果发现，采用UV诱变，随着处理时间增加，菌体致死率、正突变率显著升高，90 s的致死率最高，达到89.1%；60 s的致死率为68.3%，正突变率与90 s无显著差异，且效价最高(表1)。采用UV处理60 s，利用琼脂柱法进行初筛，得到11株正突变株，通过发酵摇瓶法复筛后，得到2株编号为TLU-1501、TLU-1502的菌株，其效价分别为12854、12973 μg/mL。

采用EMS诱变，随着处理时间增加，菌体致死率、正突变率显著升高，5 h的致死率最高，达到93.7%；4 h的致死率为66.1%，正突变率与5 h无显著差异，且效价最高(表1)。采用EMS处理4 h，得到1株编号为TLE-1501的优良菌株，其发酵效价为12767 μg/mL。

采用LiCl+UV复合诱变，得到23株正突变株，复筛后获得2株编号为TLLU-1501、TLLU-1502的优良菌株，其发酵效价分别为13162、12236 μg/mL。采用EMS+UV复合诱变，得到34株正突变株，复筛后获得3株编号为TLEU-1501、TLEU-1502、TLEU-1503的优良菌株，其发酵效价分别为13427、l3873、14124 μg/mL。

表1 不同诱变方法诱变影响的比较

同一诱变方法中同列数据上标字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 不同诱变方法所选优良菌株遗传稳定性检测 对不同诱变方法获得优良菌种进行进一步复筛，

测定其遗传稳定性，结果发现，菌株TLU-1502、TLLU-1502、TLEU-1503遗传稳定性好(表2)。

表2 优良菌种遗传稳定性分析

2.3 优良菌株泰乐菌素抗性检测 将菌株TLU-1502、TLLU-1502、TLEU-1503的菌株孢子悬液稀释为1×10-4，然后分别涂布于含有15000 μg/mL泰乐菌素的培养基平板上，培养后，观察菌落的生长情况，结果发现，TLU-1502和TLEU-1503菌株的生长情况好，而TLLU-1502生长情况一般(表3)。结果表明，TLLU-1502、TLEU-1503具有较好的泰乐菌素抗性。

表3 泰乐菌素对菌株生长的影响

+++表示菌落生长好，++表示菌落生长一般。

2.4 优良菌株豆油抗性检测 将菌株TLU-1502、TLLU-1502、TLEU-1503的菌株孢子悬液稀释为1×10-4，然后分别涂布于含有4.0%豆油的平板上，以不含豆油的平板为对照。培养后，观察菌落的生长情况，结果发现，含豆油的培养基上三株菌种的菌落比不含豆油的培养基上的菌落明显大，且未见孢子(表4)。结果表明，这3个菌株均具有较好的豆油抗性。

表4 豆油对菌株生长的影响

2.5 优良菌株发酵组分的分析 将菌株选育出的优良菌株TLLU-1502、TLEU-1503以及原始菌株TL-15028进行摇瓶发酵(培养液中豆油含量40 g/L)，发酵后，分别测定它们生产泰乐菌素4种主要组分的效价以及发酵液中的残油量，结果发现，TLEU-1503菌种生产的泰乐菌素中A组分明显高于对照，而C组分低于对照(表5)。TLEU-1503发酵液中的残油量最低，说明TLEU-1503对豆油的利用效率最高(表6)。

表5 发酵液中泰乐菌素组分的比较

表6 发酵液中残油量的比较

3 讨 论

采用UV和EMS单一诱变，处理时间是关键，时间过短(处理时间30 s)，诱变的正突变率较低，时间过长(处理时间90 s)，致死率过高，均不利于后期的筛选。因此，在综合考虑致死率、正突变率、突变菌株效价的前提下，以60 s作为UV适宜的诱变处理时间。同样，在EMS诱变处理时，也是综合考虑上述指标后，以4 h作为适宜的诱变处理时间。UV诱变的机理是使菌体内同链DNA形成胸腺嘧啶二聚体，阻止碱基正常配对，进而引起突变，但UV突变易产生光修复。EMS是一种化学诱变剂，可使菌体内DNA的鸟嘌呤烷基化，导致碱基错配，进而引起突变。采用UV和EMS单一诱变，对弗氏链霉菌诱变效果可能有限，往往不及复合诱变[2]。相比单一诱变而言，复合诱变产生的突变更多，正突变率更高，其对应的表型可能更丰富，更容易选育出符合预期的优良菌株。本文所采用的LiCl+UV、EMS+UV两种复合诱变方法，其诱变效果较单一诱变更佳，其中，EMS+UV诱变效果最佳，这与徐红梅等[9]的结论一致。同时，本文对诱变得到优良菌株进行了泰乐菌素抗性、豆油抗性的定向筛选，使其更符合实际生产的要求。

相对出发菌株而言，TLEU-1503的发酵组分中泰乐菌素A含量明显提升，C含量有较大幅度的下降，有利于泰乐菌素品质的提升，这与甘士喜等的研究结论相符[11]。同时，TLEU-1503还具有较好的泰乐菌素抗性和豆油抗性，这样既可以避免发酵生产过程中不断积累的泰乐菌素的反馈抑制作用；还可以充分利用发酵液中的豆油，有助于提高生产效率。TLEU-1503发酵组分中泰乐菌素A含量明显提升，C含量大幅下降，这一现象可能是由两方面的因素造成的，首先可能是由于TLEU-1503生产泰乐菌素的效率增加了，其次可能是由于催化组分C向组分A转化的大菌素C甲基转移酶活性提高了[9,11]。弗氏链霉菌发酵生产过程中常以豆油作为碳源，豆油在被利用时，菌体必须具备较高活性的脂肪酶，TLEU-1503具有较高的豆油利用效率，这表明其菌体的脂肪酶活性较高[12]。有关TLEU-1503菌株大菌素C甲基转移酶活性和脂肪酶活性变化还有待于进一步深入研究。

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(编辑：陈希)

The Effect of Different Induction Mutation Method on Production Performance for Tylosin in TL-15028 Strain

LI Chun-ling, DING Ya-lian, XIE Wen-jing, NIU Chun, ZHANG Ping*

(NingxiaTairuiPharmaceuticalCompanyLimited,Yinchuan750101,China)

In order to screening of high yield strain for tylosin, TL-15028 strain was selected as original strain. The original strain was mutation treated with chemical mutation, physical mutation and compound mutation, respectively. The mutagenic effect of the three methods were compared. The TLEU-1503 strain, which with high inheritance stability and resistance to tylosin and soybean oil, was screened. The potency of TLEU-1503 strain, which was 14124 μg/mL, had improved 36.5% than original strain. The result had great significance for efficient production and quality improvement of tylosin.

tylosin; high yield strain; compound mutation; screening

李春玲，主要从事微生物发酵菌种选育研究。

2016-07-28

A

1002-1280 (2016) 12-0029-05

S852.6