HPLC-MS/MS检测双黄连注射液中非法添加13种喹诺酮类药物的研究

张航俊，周芷锦，侯轩，朱聪英，周炜，陈慧华

(浙江省兽药饲料监察所，杭州311100)

HPLC-MS/MS检测双黄连注射液中非法添加13种喹诺酮类药物的研究

张航俊，周芷锦，侯轩，朱聪英，周炜，陈慧华*

(浙江省兽药饲料监察所，杭州311100)

建立了高效液相色谱-串联质谱法检测兽用中药制剂双黄连注射液中非法添加13种喹诺酮类药物的方法。样品经0.2%甲酸溶液溶解后稀释，以0.2%甲酸溶液与甲醇作为流动相进行梯度洗脱，采用多反应监测模式进行测定。13种喹诺酮类药物检测限(LOD)为0.1～0.5 mg/mL，定量限(LOQ)为1～5 mg/mL，在5.0～200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99,在5、10、20 mg/mL 三个添加浓度下，平均回收率为90.9%～101.9%，相对标准偏差为0.6%～3.8%。

中兽药制剂；喹诺酮类药物；高效液相色谱-串联质谱法

喹诺酮类(4-quinolones)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，目前常用的是第三代的恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等。这类药物对多种革兰氏阴性菌有杀菌作用，广泛用于泌尿生殖系统疾病、胃肠疾病以及呼吸道、皮肤组织的革兰阴性细菌感染的治疗。因其广泛的抗菌范围、良好的治疗作用，经常被添加到一些兽用中药制剂当中以增强疗效。非法添加会令养殖户在不知情的情况下使用抗生素，不但诱发耐药性，而且还导致药物残留，对人体健康具有潜在的危害。例如环丙沙星会诱发过敏性反应如皮疹、皮肤瘙痒，氧氟沙星会引起肝脏损伤等。喹诺酮类药物作为一类广泛使用的抗生素，被滥用和非法添加的可能性较大，但是目前没有针对兽药中喹诺酮类药物非法添加的有关标准，也没有中兽药注射剂中非法添加喹诺酮类药物的液质检测方法的相关报道，本文对该检测方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 Agilent 1290N 高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；AB 5500 Q-Trap质谱仪(美国AB公司)，配电喷雾离子源(ESI)；电子天平(瑞士Mettler，精度十万分之一)。

1.2 药品与试剂

1.2.1 试剂 甲酸、甲醇(色谱纯，默克公司)；氢氧化钠(分析纯，屹达化工)；水为超纯水。

1.2.2 标准品 洛美沙星(Lomefloxacin,LOM)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、诺氟沙星(Norfloxacin,NOR)、伊诺沙星(Enoxacin,ENO)四种标准品购自中国食品药品检定研究院；氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、噁喹酸(oxolinicacid,OXO)、双氟沙星(Difloxacin,OIF)、恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、氟甲喹(Flumequine,FLU) 五种标准品购自中国兽医药品监察所；麻保沙星(Marbofloxacin,MAR)、沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、达氟沙星(Danofloxain,DAN)、培氟沙星(pefloxacin,PEF) 四种标准品购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2.2.1 标准贮备液(100 μg/mL) 精密称定相当于各药物10 mg的喹诺酮类药物标准品，分别于100 mL容量瓶中，用0.03 mol/L 氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别制成100 μg/mL的标准贮备液。-20 ℃以下保存。

1.2.2.2 混合标准工作液(1 μg/mL) 分别精密量取喹诺酮类药物标准贮备液各1.00 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成1 μg/ mL混合标准工作液。-20 ℃以下保存。

1.2.2.3 标准曲线溶液 精密量取混合标准工作液(1.2.2.2项)50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、2 mL分别置于10 mL容量瓶中，用0.2%甲酸溶液稀释定容至刻度，得到浓度5、10、20、50、200 ng/mL的标准曲线溶液。1.2.2.4 标准混标溶液 精密称取各标准品100 mg置于10 mL容量瓶中，用0.03 mol/L 氢氧化钠溶液溶解并稀释定容至刻度，制成浓度为10 mg/mL标准混标溶液,同法配置20、40 mg/mL的标准混标溶液。

1.3 供试品

1.3.1 阴性对照注射液 双黄连注射液，浙江汇特动物药业有限公司，批号：20150712。1.3.2 阳性添加注射液 精密量取5 mL 10 mg/mL的标准混标溶液，置于10 mL容量瓶中，用阴性对照注射液定容至刻度，混匀，即得5 mg/mL的阳性添加注射液，取20、40 mg/mL标准混标溶液,同法配置10、20 mg/mL的阳性添加注射液。

1.4 测定方法

1.4.1 样品处理 精密量取中兽药注射剂1 mL，置100 mL 容量瓶中，用0.2%甲酸溶液溶解，超声5 min，静置放冷至室温，用0.2%甲酸溶液定容至刻度，作为提取液；取提取液0.1 mL用0.2%甲酸溶液稀释至10 mL，作为稀释液；取稀释液0.1 mL用0.2%甲酸溶液稀释至10 mL,作为上机液；取上机液，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.4.2 色谱条件 Waters Atlantis C18 柱(3.0 mm×150 mm, 3.0 μm);进样量10 μL; 柱温30 ℃，流动相组成及流速见表1。

表1 流动相组成和流速

1.4.3 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测；离子源电压：5500 V；辅助加热气温度：500 ℃；气帘气流速(Curtain Gas)：40 L/h；脱溶剂流速：中等(Medium)；离子源气流速：雾化气(Gas 1)和辅助气(Gas 2)均为45 L/h；驻留时间(dwell time)：20 ms；13种喹诺酮类药物的定性、定量离子对及去簇电压等质谱参数见表2。

表2 喹诺酮类药物多反应检测离子对及质谱条件

*：定量离子

1.4.4 标准曲线绘制 取标准曲线溶液按1.4.2、1.4.3项所述条件进行上机测定。

2 结果与分析

2.1 线性方程与检出限、定量限 分别以定量离子峰面积为纵坐标，以工作液浓度(ng/mL)横坐标，13种药物的相关系数均大于0.99，在5.0～200 ng/mL范围内具有良好的线性关系。采用空白样品添加方法，按1.4项进行处理和检测，得到本方法13种待测药物检出限为(LOD)0.1～0.5 mg/mL，定量限(LOQ)为1～5 mg/mL。13种喹诺酮类药物的线性方程和定量限见表3，阴性对照及阴性对照定量限添加浓度MRM谱图见图1、图2。

表3 13种喹诺酮类药物的线性方程、相关系数和定量限

图1 阴性对照注射液图谱

图2 阴性对照注射液喹诺酮类药物定量限添加浓度谱图

2.2 回收率试验 取阴性对照注射液，添加三个不同浓度(5、10、20 mg/mL)喹诺酮类药物，按1.4.1项进行回收率实验，每个添加浓度做5个平行，求得其平均回收率与批内变异系数。重复三次试验，求得批间变异系数如表4所示，双黄连注射液中13种喹诺酮类药物在其添加浓度为5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL三个水平下的平均回收率为90.9%～101.9%，批间变异系数为0.6%～3.8%。

表4 双黄连注射剂中13种喹诺酮类药物的回收率

3 讨论与小结

3.1 检测方法的选择 高效液相色谱法，特异性强、定量准确，但是测定种类少，检测限很难降低[1]，中兽药制剂基质复杂，对液相分离效果要求高。本文采取的高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、测定种类多，在本文色谱条件下，25 min便能完成样品中13种喹诺酮药物的检测，干扰小、速度快、效率高。

3.2 样品处理方法的选择 中药注射剂与肉、蛋、奶、血浆等样品相比，没有蛋白和脂肪的干扰，且注射剂中药物添加量大，无需通过固相萃取柱进行净化和浓缩，直接稀释就可以起到去除干扰的作用[2-6]。按本文方法处理，简单、快捷，基质干扰小。应用本文方法抽检了板蓝根注射液、双黄连注射液、柴胡注射液、黄芪多糖注射液、鱼腥草注射液、穿心莲注射液7类共47批次的中兽药注射液，其中7批次检出喹诺酮类药物的非法添加，40批次阴性样品在喹诺酮类药物相应保留时间处均无干扰。结果表明目前在畜禽中兽药注射液中添加喹诺酮类抗菌药物以提高治疗效果的现象确实存在。

本文建立了高效液相色谱-串联质谱法检测中兽药注射剂中非法添加13种喹诺酮类药物的方法。结果表明，该方法样品处理简便、快速，检测结果准确、可靠，对于其他中兽药制剂中检测喹诺酮类药物的非法添加具有借鉴意义。

[1] 农业部.中华人民共和国农业部公告第1025-14-2008号[S]．

[2] 温中明，李东，徐玉红.高效液相色谱法同时测定人血浆中多种喹诺酮类药物浓度[J].中国药业，2011,20(14)：25-27．

[3] GB/T 21312-2007．动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法[S]．

[4] 李佩佩，郭远明，陈雪昌，等.色谱法检测动物源食品中喹诺酮类药物残留研究进展[J].食品科学,2013,(3):303～307．

[5] 中国兽药典委员会．中华人民共和国兽药典二○一○年版(一部)[S]．

[6] 农业部.中华人民共和国农业部公告第2508 号[S]．

(编辑：侯向辉)

Determination of Illegally Added 13 Quinolones in Shuanghuanglian Injection by HPLC-MS/MS

ZHANG Hang-jun,ZHOU Zhi-jin, HOU Xuan，ZHU Cong-ying, ZHOU Wei，CHENG Hui-hua*

(ZhejiangProvincialSupervisoryInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff，Hangzhou311100，China)

A method of HPLC-MS/MS was developed to determine 13 quinolones illegally added in traditional Chinese medicine for animal. The sample was dissolved and diluted with 0.2% formic，then separated with HPLC which was using gradient elution with methanol and 0.2% formic acid. Qualitative and quantitative analysis of the 13 quinolones were carried out in multiple reactions monitoring mode (MRM)．The limits of detection (LODs) of 13 quinolones were in the range of 0.1～0.5 ng/mL，the limits of quantitation (LOQs) of 13 quinolones were in the range of 1～5 mg/mL. The correlation coefficient of 13 quinolones in the range from 5.0 to 200 ng/mL was greater than 0.99. The results showed that when the concentrations of 13 quinolones were between 5 and 20 mg/mL, the average recoveries ranged from 90.9% to 101.9%, with relative standard deviations of 0.6% - 3.8%.

traditional Chinese medicine for animal; quinolones;HPLC-MS/MS

张航俊，本科，从事兽药、畜产品质量安全检测研究。

2016-06-27

A

1002-1280 (2016) 12-0059-06

S859.83