1,4-二氧喹醛酸酯合成及抑菌活性研究

马明真，李风梅，高宝生，宋俊芬，罗星，李华

(中国农业大学烟台研究院，烟台 264670)

1,4-二氧喹醛酸酯合成及抑菌活性研究

马明真，李风梅，高宝生，宋俊芬，罗星，李华*

(中国农业大学烟台研究院，烟台 264670)

为了合成两种具有抑菌活性的1,4-二氧喹醛酸酯，即1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯和 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯，以苯并呋咱为原料，经Beirut反应、酯交换反应，合成了两种喹醛酸酯；1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯合成产率为29.3%，1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯合成产率为18.3%。两种1,4-二氧喹醛酸酯对大肠杆菌、金葡萄球菌、青霉菌和枯草杆菌均有明显的抑菌活性。通过测定产物的熔点和光谱分析证明系为所合成的目标产物。

苯并呋咱；酯交换反应；喹醛酸酯；抑菌活性

1,4-二氧喹喔啉类衍生物具多种生物活性[1-3]，已在许多领域中广泛报道[4-6]。其具有明显的抑菌活性[7-8],并能促进饲料消化吸收和提高饲料转化率[9-10]，对畜禽的饲养有重大意义,所以被广泛用作兽药[11-12]进行研究。

国家级一类新兽药喹烯酮，具有抑菌促生效果好、低毒、低残留、无三致作用的特点，且使用安全，是农业部重点推广的兽药[10，13]。目前针对喹烯酮的研究多集中在合成工艺、药理、毒理等方面[13-15]，较少涉及喹烯酮的转型升级及结构创新。在保证安全有效、生物学活性较高的前提下，有必要制备各具特色、结构多样的喹喔啉衍生物，以适应我国畜禽养殖疾病防控和食品安全的需求。

本文以苯并呋咱为原料，经Beirut反应、酯交换反应，合成了两种新喹喔啉衍生物，即1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯和 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯，并用滤纸片法[5]对其抑菌活性进行了研究，以期为新兽药的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 分析天平，WT-B 型，上海精密科学仪器产品；恒温磁力搅拌器，85-1型，江苏荣华仪器产品；循环水式真空泵，SHZ-D 型，河南巩义予华仪器产品；万调万用电炉，DL-1 型，山东龙口先科仪器产品；电热恒温鼓风干燥箱，DHG-9140A型，嘉兴中新医疗仪器产品；压力蒸汽灭菌器，YX280A型，上海三申医疗器械产品；电热恒温培养箱，420型，山东龙口先科仪器产品；超净工作台，SW-CJ型，苏州安泰空气技术公司产品；游标卡尺、接种针、打孔器、镊子、滤纸等均为市售。

苯并呋咱(按文献[16-17]方法自制)；乙醇、苯酚，均为分析纯，天津永大化学试剂产品；乙酰乙酸乙酯，分析纯，天津福晨化学试剂产品；乙酸乙酯、甲醇，均为分析纯，天津科密欧化学试剂产品；盐酸，分析纯，烟台三和化学试剂产品；三乙胺，分析纯，天津广成化学试剂产品；肉桂醇，分析纯，上海阿拉丁生化科技产品；营养琼脂，青岛海博生物技术产品。供试菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌。以上菌种均由中国农业大学生物所提供。

1.2 喹醛酸酯合成

1.2.1 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯的制备 取苯并呋咱20 g(163.93 mmoL)加入25 mL乙酰乙酸乙酯，水浴加热(40 ℃)搅拌溶解，溶液呈橙黄色。冷水浴(15 ℃)，缓慢加入40 mL三乙胺，溶液呈红色，静置在底部和边缘可看到土黄色晶体析出，24 h后抽滤，乙醇洗涤得粗品。60 ℃烘干，甲醇重结晶。合成路线如图1所示。

图1 Beirut反应

1.2.2 1,4-二氧喹醛酸酯制备 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯的合成：取5 g 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯放入烧杯中，加入25 mL乙醇，加热搅拌40 min，温度控制在50～60 ℃，全部溶解后，加入2.5 g苯酚，回流5 min(77 ℃)后，滴加1 mL盐酸，继续回流2 h，减压蒸馏回收乙醇，得深红色粘稠反应产物，加50 mL乙酸乙酯，室温静置，析出晶体。抽滤，用蒸馏水洗涤，得土褐色固体。60℃烘干，乙酸乙酯重结晶。合成路线如图2所示。

1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯的合成：取5 g 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯放入烧杯中，加入30 mL乙醇，加热搅拌40 min，温度控制在50～60 ℃，全部溶解后，加入4 mL肉桂醇，回流5 min(77 ℃)后，滴加1.5 mL盐酸，继续回流2 h，减压蒸馏回收乙醇，得深红色粘稠反应产物，加50 mL乙酸乙酯，室温静置，用超声分散20分钟，析出沉淀。抽滤，用蒸馏水洗涤，得褐色固体。60℃烘干，乙酸乙酯重结晶。合成路线如图3所示。

图2 与苯酚的酯交换反应

图3 与肉桂醇的酯交换反应

1.3 抑菌试验

1.3.1 培养基的制作 称取营养琼脂17.5 g，放入盛有500 mL蒸馏水的烧杯中，在电炉上加热，用玻璃棒不断搅拌，防止琼脂粉末粘到烧杯底部，溶解至溶液呈通澈状态，停止加热，稍稍冷却后倒入三角瓶中，在压力蒸汽灭菌器中高压灭菌20 min。

1.3.2 滤纸片法 将高压灭菌后的琼脂培养基趁热倒入灭菌培养皿中，冷却凝固后，用接种针从菌落上轻轻抹上一些细菌，均匀地涂抹在培养皿中的琼脂平板上；选取优质滤纸，用打孔器打出直径为6 mm的滤纸片，用压力蒸汽灭菌器高压灭菌20 min；用蒸馏水分别配制0.5、1.5、2.0、2.5 mg/mL的1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯和1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯溶液各50 mL；用无菌镊子夹取一定数量的灭菌滤纸片，放在药品中充分浸湿后，贴在含菌培养皿上，每只培养皿内间隔一定的距离贴3片，用浸有去离子水的滤纸做空白对照，每种处理做两组重复，以上操作均在超净工作台上进行；将培养皿放入28 ℃电热恒温培养箱中培养48 h；用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验中出现的抑菌圈直径越大，说明药品的抑菌活性越强。

2 结果

2.1 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯制备 苯并呋咱和乙酰乙酸乙酯的用量比值为1∶1.25，保持乙酰乙酸乙酯过量，反应进行的较为彻底，产率为65.44%，熔点153.1 ℃～153.9 ℃。

2.2 1,4-二氧喹醛酸酯制备 本文研究了两种1,4-二氧喹醛酸酯的制备反应，均在浓盐酸催化下进行。苯酚与1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯发生酯交换反应，得到土红色松散晶体，产率为29.3%，熔点135.9 ℃～136.8 ℃；肉桂醇与1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯发生酯交换反应，得到肉色松散晶体，产率为18.3%，熔点138.7 ℃～139.1 ℃。

2.3 抑菌试验 用去离子水作对照，采用滤纸片法对两种喹醛酸酯进行了抑菌活性测试。结果表明，不同浓度的1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯和1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯对大肠杆菌、金葡萄球菌、青霉菌和枯草杆菌的抑菌圈直径均明显比对照组大，随着药品浓度的增加，抑菌圈直径呈明显增大的趋势(表1、表2)。在1.5 mg/mL浓度下1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯对金葡萄球菌和1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯对大肠杆菌的抑菌照片见图4。

表1 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯体外抑菌试验的抑菌圈直径 单位：mm

(x±s ,n=5)

表2 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯体外抑菌试验的抑菌圈直径 单位：mm

(x±s ,n=5)

图4 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯对金葡萄球菌的抑菌结果(A)和1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯对大肠杆菌(B)的抑菌结果(化合物质量浓度为1.5 mg/mL)

2.4 目标产物结构分析

2.4.1 红外光谱(IR) 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯：2996 cm-1强峰是-CH3伸缩振动吸收谱带，1738 cm-1强峰是C=O的伸缩振动吸收谱带，1332 cm-1强峰是N-O伸缩振动吸收谱带，1244 cm-1强峰是C-O伸缩振动吸收谱带。770 cm-1中强峰是苯环邻位双取代特征吸收谱带。其中1332 cm-1的强吸收峰是取代喹喔啉-1,4-二氧化物的特征吸收峰[18]。

1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯：2997 cm-1强峰是-CH3伸缩振动吸收谱带，1739 cm-1强峰是C=0的伸缩振动吸收谱带，1521 cm-1强峰是C=C伸缩振动吸收谱带，1332 cm-1强峰是N-O伸缩振动吸收谱带，1244 cm-1强峰是C-O伸缩振动吸收谱带。770 cm-1中强峰是苯环邻位双取代特征吸收谱带。其中1332 cm-1的强吸收峰是取代喹喔啉-1,4-二氧化物的特征吸收峰(图5-图6)。

图5 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯的红外光谱图

图6 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯的红外光谱图

2.4.2 质谱(MS) 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯[M]:最大质荷比m/z=295.66，基峰m/z=294.66。确定该化合物分子量为296，分子式为C16H12O4N2。

1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯[M]:最大质荷比m/z=334.89，基峰m/z=334.02。确定该化合物分子量为336，分子式为C19H16O4N2(图7-图8)。

2.4.3 核磁共振谱(1HNMR) 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯δppm: 8.72～8.56(2H),8.05 (2H)，7.45(2H), 7.37(2H)，7.05(1H)，2.51(3H)。

1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯δppm: 8.62～8.56(2H)，7.91～7.83 (2H)，7.33～7.25(2H), 7.17(2H)，6.95(1H)，6.15(2H)，4.05～3.87(2H)，2.51(3H)(图9-图10)。

图7 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯的质谱图

图8 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯的质谱

图9 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸苯酯的1HNMR谱图

图10 1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯的1HNMR谱图

3 讨论与小结

1,4-二氧喹喔啉衍生物具有显著的抑菌活性,被广泛用作兽药进行研究。目前，国内围绕喹烯酮的制备方法、催化剂改进及喹烯酮衍生物方面的研究较多，如唐树和等[16]报道了以碳酸钠作催化剂进行Beirut反应制备3-甲基-2-乙酰基一喹喔啉-1，4-二氧化物的合成工艺路线、戴述诚等[15]报道将催化剂甲醇钠改为盐类催化剂，对喹烯酮的合成工艺路线和合成方法进行了改进；但在其转型升级方面的研究较少，特别是结构创新方面的研究报道,如魏晓然等[19]研究了3-甲基-2-[3-(2-呋喃基)丙烯甲酰]-喹喔啉-1,4-二氧化物的合成较为少见。在保证安全有效的前提下，制备结构各具特色的喹喔啉衍生物的研究亟待加强。

为合成新喹喔啉衍生物，以苯并呋咱为原料，经Beirut反应和酯交换反应，分别将苯酚和肉桂醇引入1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸乙酯上，合成了两种喹醛酸酯。

在贝鲁特缩合反应中，在三乙胺的催化下苯并呋咱和乙酰乙酸乙酯反应，可以不用另加溶剂，乙酰乙酸乙酯既做反应物同时也是溶剂。实验过程中发现，用二乙胺作催化剂需冰水冷却，反应速度快，但会产生大量红褐色油状物，产率低；用三乙胺作催化剂，反应时间较长，但反应温和，产率高。每克苯并呋咱用2 mL三乙胺和1.25 mL乙酰乙酸乙酯时产率较高。与文献[6]相比，乙酰乙酸乙酯的用量减少了13%，三乙胺的用量减少了72%，用甲醇替代丙酮进行重结晶，最终产率提高了10%。

在酯交换反应中，试验中用易挥发的浓盐酸做催化剂，保持在溶剂乙醇微沸的条件下进行反应。由于酯交换平衡的影响，会使目的产物的产率较低，因此，在反应过程中采取减压蒸馏蒸出乙醇，从而提高目的产物的产率。反应得到的产物为红褐色粘稠状物质，加入乙酸乙酯后析出沉淀。但在合成1,4-二氧喹喔啉-3-甲基-2-甲酸肉桂酯时出现了不沉淀的现象，试验发现，用超声分散20 min即可析出沉淀获得产物。

通过红外光谱、质谱和核磁共振谱鉴定证明了所得化合物系目标产物，说明该合成路径是合理有效的。同时，滤纸片抑菌试验说明了两种化合物对4种供试菌种均具有明显的抑菌活性。

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(编辑：陈希)

Study on the Synthesis and Bacteriostasis of 1,4-dioxide Quinoline Aldehydes Esters

MA Ming-zhen,LI Feng-mei，GAO Bao-sheng，SONG Jun-fen，LUO Xing，LI Hua*

(ChinaAgricultureUniversity(Yantai) ，Yantai264670,China)

Using benzofuroxan as raw material , two kinds of 1,4-dioxide quinoline aldehydes esters, 1,4-dioxide quinoline-3- methyl -2- phenyl formate and 1,4-dioxide quinoline-3- methyl -2- cinnamylformate , were synthesized by Beirut reaction and ester exchange reaction. The yield of 1,4-dioxide quinoline-3- methyl -2- phenyl formate was 29.3% and the yield of 1,4-dioxide quinoline-3- methyl -2- cinnamylformate was 18.3%. Two kinds of 1,4-dioxide quinoline aldehyde ester have obvious antibacterial activity toEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Penicilliumsp. andBacillussubtilis. It was proved that new compounds synthesized in experiment were target compounds by measuring the melting point and spectral analysis.

benzofuroxan; ester exchange reaction; quinoline aldehydes esters; antibacterial activity

烟台市科技发展计划项目(2012ZH247)

马明真，从事设施农业科学与工程专业方面研究。

李华。E-mail：8540890692@qq.com

2016-03-19

A

1002-1280 (2016) 06-0026-07

S859.79