人脐带间充质干细胞对裸鼠的促瘤和致瘤性研究

谢长峰杜杰曾桂芳徐绍坤梁晓李婵左丛林刘沐芸胡祥

·论著·

人脐带间充质干细胞对裸鼠的促瘤和致瘤性研究

谢长峰1杜杰2曾桂芳1徐绍坤1梁晓1李婵1左丛林2刘沐芸1胡祥1

目的 研究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）对动物是否具有促瘤性，以及不同代次是否有致瘤性，为其临床应用提供安全性依据。方法 分别用人淋巴瘤细胞Raji接种于CB-17 SCID小鼠皮下、用人结肠癌细胞WiDr接种于BALB/c裸鼠皮下，建立皮下移植瘤模型，WiDr成模动物用完全随机法分为4组（n = 8）：模型对照组、hUCMSCs低、中、高剂量组；Raji成模动物用完全随机法分为5组（n = 7）：空白对照组、模型对照组、hUCMSCs低、中、高剂量组。hUCMSCs均静脉注射给药，观察hUCMSCs对皮下移植瘤的增殖是否有影响。另外，观察不同代次的hUCMSCs是否有致瘤性，NOD/SCID小鼠分别皮下接种hUCMSCs的第2、6、10代的细胞，注射后3周，16周对动物剖检，观察hUCMSCs皮下结节的形成及是否有肿瘤转化的倾向。对照组和hUCMSCs组的瘤体积及瘤重采用成组t检验进行统计分析，并计算hUCMSCs组相比对照组的相对肿瘤抑制率T/C％。结果 WiDr肿瘤模型中，第43天hUCMSCs中、高剂量组的瘤体积均显著低于模型对照组，分别为（586.7±274.4）mm3、（689.5±114.8）mm3vs（945.9±234.0）mm3，P ＜ 0.05，但T/C％值＞ 40％；第51天hUCMSCs低、中高剂量组瘤体积均显著低于模型对照组，分别为（777.8±346.7）mm3、（793.1±358.6）mm3、（800.7±116.5）mm3vs（1300.0±356.8）mm3，P均＜0.05，但T/C％值均＞ 40％；表明hUCMSCs在3个剂量下均未对WiDr肿瘤的生长有影响，无显著促进或抑制作用。Raji肿瘤模型中，hUCMSCs治疗组瘤体积与对照组相比在所有时间点差异均无统计学意义（P ＞ 0.05），显示hUCMSCs在本实验条件下对肿瘤生长没有明显的抑制和促进作用。两个模型的病理检测均未见对肿瘤增殖有明显影响。3个不同代次的hUCMSCs注射到NOD/SCID后16周对动物剖检，也没有观察到肿瘤转化的倾向。结论 hUCMSCs对裸鼠WiDr和Raji移植瘤模型的肿瘤增殖无促进作用，不同代次的hUCMSCs在NOD/SCID裸鼠体内移植也不具有致瘤性。

脐带； 间质干细胞； 致瘤性； 促瘤性

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的间叶组织来源干细胞，可从胎儿血液、肝脏、骨髓、脂肪等多种组织获得，是一群多潜能细胞，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化[1]。人脐带间充质干细胞（human umbilical cordderived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）作为理想的MSCs来源越来越受到人们的重视，关于hUCMSCs的研究报导也越来越多。hUCMSCs具有特殊的免疫学表型，不表达HLA-Ⅱ类分子和共同刺激分子，不会引起同种异体淋巴细胞增殖反应[2]。移植入宿主体内的MSCs可避免宿主的免疫排斥反应，通过细胞间的相互作用及旁分泌作用等机制抑制过度活跃的T细胞的增殖及其过度免疫反应[3]，从而发挥免疫重建的功能，进而有可能在自身免疫疾病方面取得较好的疗效[2]。以上特点为hUCMSCs在临床上应用于自身免疫性疾病提供了理论依据，但会不会因为其免疫抑制特性而诱发业内最为关注的干细胞致瘤性问题，已有研究认为骨髓来源的MSCs在体内外均有促进肿瘤生长的作用[4-5]。那么脐带来源的MSCs是否也有同样的作用，之前已经通过软琼脂克隆实验及共培养对肿瘤细胞增殖的影响实验，揭示了hUCMSCs体外不具有致瘤性[6]，本文旨在进一步通过动物实验研究hUCMSCs是否在动物体内具有致瘤性及促瘤性，为其临床使用提供安全性数据。

材料和方法

一、材料

hUCMSCs（深圳市北科生物科技有限公司生产）；人胚肺成纤维细胞（MRC-5）、人宫颈癌细胞（Hela）、人结肠癌细胞WiDr、人淋巴瘤细胞Raji均购于中国医学科学院基础研究所细胞中心；SPF级雌性BALB/C裸小鼠，动物周龄约4 ～ 5周，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物质量合格证编号：0157988；雌性CB-17 SCID小鼠，动物周龄约4 ～ 5周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证编号：0196881、0199950；SPF级NOD/ SCID小鼠，动物周龄为4 ～ 5周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物质量合格证编号：0157641；动物饲养于屏障环境中的IVC笼内。本实验中所有动物的使用均经过实验动物伦理委员会的批准，批准号为ACU-09-227。

二、方法

1.促瘤实验：体内促瘤试验采用实体瘤WiDr和血液系统肿瘤Raji各1株，将对数生长期人结肠癌细胞WiDr细胞或人淋巴瘤细胞Raji浓度调整为5×107个/ml，以BALB/c裸鼠皮下注射WiDr细胞0.2 ml及CB-17 SCID小鼠皮下注射Raji细胞0.2 ml造F0代荷瘤小鼠，待肿瘤生长至400 mm3，选择肿瘤生长及健康状况良好的荷瘤动物，无菌条件下取瘤，制备成3 mm3左右组织块，分别接种于动物右侧腋窝皮下制备BALB/c裸鼠人结肠癌细胞WiDr肿瘤模型和CB-17 SCID小鼠人淋巴瘤细胞Raji肿瘤模型。成模动物随机分为4组：模型对照组、hUCMSCs低、中、高剂量组，每组7 ～ 8只动物，Raji模型另设空白对照组。实验组尾静脉注射给药，隔14天1次，共2次分别给予P2代hUCMSCs 2×105个细胞/只、6×105个细胞/只、2×106个细胞/只，给药体积为0.5 ml，对照组给予相应体积的溶媒。每天进行一般临床观察，每周1次详细临床观察，每周2次称量体质量并测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积、相对肿瘤体积（RTV）和相对肿瘤增殖率T/C％，如果140％＞T/C％＞ 40％，为无影响；如果T/C％≤40％或≥140％，且经统计学处理P ＜0.05为有影响[7]。两个模型试验的动物安乐死后均剥离肿瘤结节、称重，计算肿瘤抑制率，抑制率≥60％且经统计学处理P ＜ 0.05时为对肿瘤增殖有抑制作用，抑制率＜ -40％且经统计学处理P ＜ 0.05时为对肿瘤增殖有促进作用[8]；同时进行大体解剖观察，取材心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肿瘤结节用10％中性福尔马林作常规固定，石蜡包埋、切片、HE染色、显微镜下观察。

2.致瘤性实验：为验证多次传代后hUCMSCs是否具有致瘤性，采用两条脐带不同代次（分别为P2、P6、P10）的细胞进行实验，以Hela细胞为阳性对照，以MRC-5细胞作为阴性对照，每组分别按照1×107个细胞/只的剂量腋窝皮下注射于10只NOD/SCID小鼠，雌雄各半，连续观察16周，主要观察指标为小鼠皮下是否出现结节以及出现结节的病理类型，以判断hUCMSCs是否存在体内致瘤的倾向。判断标准为在阴性和阳性对照成立的前提下，待检细胞皮下接种NOD/SCID小鼠后无肿物生长或虽有隆突状肿物生长但却是非肿瘤的，证明该细胞无致瘤性，判为阴性（－）；若有隆突状肿物生长，经病理形态学观察、肿瘤鉴定证实确为肿瘤的，则判为阳性（＋）。

三、统计学分析方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，不同组别动物的瘤体积或瘤重数据以± s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、促瘤性实验结果

（一）一般临床观察

WiDr肿瘤模型实验过程中，模型对照组、中剂量组和高剂量组均有动物出现活动减少、消瘦和死亡，推测与肿瘤负荷有关，非干细胞作用。Raji肿瘤模型对照组和低剂量组有动物出现消瘦、精神不振和死亡，各组均有动物出现肿瘤破溃现象，空白对照组动物皮下无结节形成。肿瘤的破溃考虑是由于淋巴瘤细胞自身的异质性程度较高和易转移性所致，非干细胞作用。

两个模型中，各剂量组在整个试验过程中的平均体质量和对照组相比差异均无统计学意义。在整个试验过程中，各剂量组的平均体质量与对照组相比均差异均无统计学意义。

（二）对移植瘤生长情况的影响

WiDr肿瘤模型中，首次给药后每周2次测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积Vt。结果可见：给药后第43天中、高剂量组和给药后第51天的低、中、高剂量组的Vt值均显著低于模型对照组（P ＜0.05），但T/C％值均＞ 40％；其他时间点各剂量组T/C％值均＞ 40％，Vt值与对照组相比差异无统计学意义（表1）。根据判断标准[7]，判定供试品在3个剂量下均未对WiDr肿瘤的生长有影响，无显著促进或抑制作用。

表1 hUCMSCs对小鼠WiDr模型肿瘤体积的影响（mm3，± s）

表1 hUCMSCs对小鼠WiDr模型肿瘤体积的影响（mm3，± s）

注：hUCMSCs为人脐带间充质干细胞，与模型对照组比较，aP ＜ 0.05

组别例数第1天第13天第28天第43天第51天模型对照组832.3±11.6286.5± 72.5544.8±160.3945.9±234.01300.0±356.8低剂量组831.9± 9.0208.3±105.9461.8±243.5680.8±304.5 777.8±346.7a中剂量组832.7±10.2164.2± 70.9362.9±159.8 586.7±274.4a793.1±358.6a高剂量组832.9±20.7190.3±117.7435.4±117.0 689.5±114.8a800.7±116.5aF值0.0082.5101.4533.2165.336 P值0.9990.0790.2490.0380.005

Raji模型肿瘤中，给药后每周2次测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积Vt。结果可见：高、中、低剂量组Vt值与对照组相比在所有时间点差异均无统计学意义（P ＞ 0.05，表2），显示供试品在本实验条件下对肿瘤生长没有明显的抑制和促进作用。

（三）对肿瘤重量的影响

WiDr肿瘤模型中，高剂量组的平均瘤重低于模型对照组[（1.21±0.27）g vs（1.73±0.44）g，P ＜ 0.05]，低、中剂量没有明显差异[分别为（1.73± 0.44）g和 （1.37±0.68）g]。低、中、高剂量组对肿瘤生长的抑制率分别为21％、31％和30％，但均未达到40％，提示供试品三个剂量对肿瘤重量均无明显影响。

Raji肿瘤模型中，模型组和低、中、高剂量组平均瘤重分别为（1.4±0.3）g、（1.8±0.6）g、（1.9±0.5）g和（1.6±0.7）g。供试品各剂量组与模型对照组差异无统计学意义，提示供试品3个剂量对肿瘤重量均无显著影响。

（四）病理检测

WiDr肿瘤模型病理切片可见：各组样本的肿瘤结节在中央或一侧出现单发或多发的灶状大面积坏死，有的形成空腔，周围肿瘤组织排列成不规则腺体状，细胞呈有核分裂相，见图1。各组样本肿瘤结节均为皮下接种人结肠癌细胞WiDr所致。由此推论hUCMSCs对裸鼠实体肿瘤的生长无促进作用。

Raji肿瘤模型组及给药低、中、高剂量组动物，均可见右侧前肢的腋窝处有肿瘤结节，生长良好，未见破溃等明显异常。肿瘤结节镜检结果显示，肿瘤细胞聚集成较大团块，细胞大小不一，形态不整，团块中央大片不规则坏死并伴有出血，多见病理性核分裂相见图2。剖检各脏器内均未见肿瘤细胞转移。由此推论hUCMSCs对裸鼠血液系统肿瘤的生长无促进作用。

二、致瘤性实验结果

阴性对照组（MRC-5）在细胞接种后，本组10只动物的接种部位均未出现结节。部分动物（6/10）于第4周实施安乐死，剩余动物继续观察至16周实施安乐死。安乐死动物的接种部位及周围均未见结节生长（表3），大体解剖观察亦未见各脏器或组织有异常现象。

表2 hUCMSCs对小鼠Raji模型肿瘤体积的影响（mm3，± s）

表2 hUCMSCs对小鼠Raji模型肿瘤体积的影响（mm3，± s）

注：hUCMSCs为人脐带间充质干细胞

组别例数第1天第7天第13天第28天第31天模型对照组7117.0±64.9284.9±160.5543.1±294.52013.2±617.72493.9±1013.1低剂量组7132.6±83.7315.3±189.6595.6±242.02088.2±748.42957.4±1032.2中剂量组7121.7±68.2313.4±147.6546.5±190.92199.3±501.62864.5± 643.8高剂量组7117.0±65.0252.2±181.0506.9±305.12107.3±967.92474.5± 139.0 F值0.0750.2120.1350.0770.690 P值0.9730.8880.9380.9720.567

图1 光学显微镜下观察WiDr模型各组肿瘤结节 （HE染色×100）

表3 不同代次的hUCMSCs动物体内的致瘤情况

图2 光学显微镜下观察Raji模型各组肿瘤结节 （HE染色×100）

阳性对照组（Hela细胞）在接种后的第8天，有2只动物出现结节，体积约为23.1 mm3和11.7 mm3。随后，动物陆续出现结节，结节均表现为进行性生长。至观察期第8周时结节的平均长径达1.4 cm，短径达1.1 cm，全部动物实施安乐死，大体解剖观察见9/10只动物有结节形成（表3），病理组织学切片检查结果发现,结节中间大面积坏死灶，周围肿瘤细胞成簇分布，并可见核分裂相，细胞增殖活跃（图3）。

图3 光学显微镜下观察 hUCMSCs致瘤性实验各组接种部位 （HE染色×100）

hUCMSCs P2组细胞接种后有动物出现较明显结节，结节均表现为退行性生长状态，至接种后第17天结节全部消失，持续时间为7 ～ 9 d，之后观察至16周终止实验，均无结节再次出现。hUCMSCs P6组接种细胞第5天，有动物出现较明显结节，结节均表现为退行性生长状态，至接种后第14天结节全部消失，持续时间为6 ～ 9 d，之后观察至16周终止实验，均无结节再次出现。hUCMSCs P10组接种细胞第5天，本组有动物出现较明显结节，结节均表现为退行性生长状态，继续观察，至接种后第11天结节全部消失，持续时间为5 ～ 6 d，之后观察至16周终止实验，均无结节再次出现。以上3组安乐死后动物大体解剖及组织病理学检测见注射部位皮肤及皮下组织未见明显异常（图3，表3）。

讨 论

hUCMSCs具有免疫抑制和免疫豁免特性，这与其免疫调节因子（血管内皮生长因子和白介素-6）、协同刺激表面抗原（CD40、CD80和CD86）和HLA-G6的表达有关[9]。hUCMSCs本身免疫原性低，表达中等水平的MHC-I类分子，不表达MHC-II类分子，可以通过分泌可溶性细胞因子诱导T细胞活化受阻，从而改变T细胞和DC表型，并在体外抑制CD4+和CD8+T细胞增殖[9]。孙凌云等[10-16]即利用此特性进行了hUCMSCs治疗系统性红斑狼疮的临床研究，结果发现hUCMSCs治疗安全、耐受性良好，临床疗效显著而持久。

采用华通氏胶组织块贴壁法培养得到hUCMSCs，其形态、表面标志物及诱导分化能力符合ISCT关于MSCs的标准[17]；软琼脂克隆实验证实体外培养时hUCMSCs无致瘤性；与人白血病细胞K562和人结肠癌Colo-205细胞体外共培养实验证实在体外hUCMSCs对肿瘤细胞的增殖没有影响[6]。

BABL/c裸小鼠先天胸腺发育不良，不能产生胸腺依赖型T细胞，NOD/SCID和CB-17 SCID裸小鼠均存在联合免疫缺陷并有T细胞和B细胞缺乏[18]，因此比较适合用于致瘤性评价。本次采用裸小鼠进行体内致瘤性和促瘤性实验，以全面考察hUCMSCs的致瘤性。

在体内促瘤性实验中，WiDr模型对照组在第51天时肿瘤结节直径超过20 mm，Raji模型在第31天时所有模型动物均出现肿瘤破溃现象，根据人道终点的原则分别定为两个肿瘤模型的终止点。WiDr模型中，给药后第43天中、高剂量组和给药后第51天低、中、高剂量组的Vt值均显著低于模型对照组（P ＜ 0.05），但T/C％均大于40％，以肿瘤体积计算的肿瘤相对抑制率均未达到40％的标准[7]，认为供试品不抑制肿瘤生长。肿瘤重量数据显示，供试品低、中、高剂量组平均瘤重均低于模型对照组且高剂量组差异有统计学意义（P ＜ 0.05，抑制率依次为21％、31％和30％），但抑制率均小于40％，未达到抑制肿瘤生长的标准[8]，虽然如此，这些异常结果仍然提示hUCMSCs与肿瘤生长的关系非常复杂，需要进一步的深入研究。病理检测提示，阳性对照组及3个实验组肿瘤结节形态在镜下观察无明显差异，结节内部存在坏死灶，细胞形态多样，杂乱无章，多处核分裂像，符合增生活跃的结肠癌肿瘤形态。Raji模型，3个剂量组Vt值与对照组相比在所有时间点差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。肿瘤重量数据显示，低、中、高剂量组平均瘤重均高于模型对照组，依次为134％、138％、118％，但差异无统计学意义（P ＞ 0.05），因此hUCMSCs静脉注射对Raji模型淋巴细胞瘤的增殖没有明显影响，与文献报道一致[19]。Raji模型实验终止时，所有动物皮下结节均有破溃现象，病理检查为恶性生长的淋巴细胞相，局部有坏死灶，符合增生活跃的淋巴瘤形态。经过实体瘤WiDr模型和血液系统肿瘤Raji模型的皮下成瘤实验，从肿瘤的体积、重量、病理形态三个方面综合分析，认为hUCMSCs对两种来源的肿瘤增殖没有抑制或促进作用。该结果与之前体外研究结果一致[6]。

为较全面研究hUCMSCs体外多次传代后其致瘤性会否发生改变，选用了两个不同来源的脐带的P2、P6和P10代次细胞进行了裸鼠体内致瘤性实验。hUCMSCs3个代次细胞接种于BABL/c裸小鼠皮下，各组均有部分动物接种部位出现结节，经过病理切片检查证实为非肿瘤性纤维组织增生。分析其原因可能是：hUCMSCs接种于小鼠皮下后，因人类细胞体积较大且一次性局部接种细胞量多而不能被动物机体完全吸收或清除，对注射部位及其周围组织产生刺激，引起局部炎性细胞浸润，伴随结缔组织增生，形成体表可见的结节，但因为hUCMSCs本身不具有致瘤性，在动物体内非无限制增殖，早期炎症反应随时间逐步减退，结节随之缩小，呈退行性生长表现。因此，在本实验中接种hUCMSCs的动物在接种的几天后出现明显结节，随着机体的组织修复，炎症反应减退，坏死的组织细胞被巨噬细胞清除，结节逐渐减少至消失。本实验中6个hUCMSCs实验组动物在注射后结节形成和消失的趋势一致，表明因为炎症反应产生皮下局部结节的推测是可信的；并且其生长模式和阳性对照组Hela细胞皮下接种后形成的结节呈进行性增长模式不同，在实验终止时，6个实验组全部动物注射部位局部已经完全没有结节的痕迹，而阳性对照组，存在肉眼可见的皮下结节，且对结节进行病理切片观察，可以看到符合肿瘤细胞活跃增殖的核分裂像，这些实验结果都提示，无论hUCMSCs体外传代扩增至第2代、第6代还是第10代，移植至动物体内均不具有致瘤性，与许键炜等[20]第4代hUCMSCs体内致瘤性研究结果一致。

然而，鉴于MSCs与肿瘤细胞之间复杂的相互作用，尚需要更多、更深入的研究才能更全面地揭示hUCMSCs临床应用的致瘤和促瘤风险。

hUCMSCs对裸鼠WiDr和Raji移植瘤模型的肿瘤增殖无促进作用，同时不同代次的hUCMSCs在NOD/SCID裸鼠体内移植也不具有致瘤性。

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Experimental investigation on tumorigenicity of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in nude mice

Xie Changfeng1, Du Jie2, Zeng Guifang1, Xu Shaokun1, Liang Xiao1, Li Chan1, Zuo Conglin2, Liu Muyun1, Hu Xiang1.1Shenzhen Beike Bio-Technology Company Limited, Shenzhen 518062, China;2Joinn Laboratories Company Limited, Beijing 100176, China

Liu Muyun, Email:muyun@beike.cc

Objective To study whether human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUCMSCs) has tumor enhancement effect and tumoroginicity in nude mice, and to provide safety evidence for clinical use. Method hUCMSCs were intravenously injected into colo-205 bearing BALB/c nude mice and Raji bearing CB-17 SCID mice to evaluate its effects on tumor growth. WiDr animals were randomized into 4 groups (n = 8 for each group)∶ model group, hUCMSCs low, median and high dose groups. Raji animals were randomized into 5 groups (n = 7 for each group)∶ control group, model group, hUCMSCs low, median and high dose groups. P2, P6and P10 hUCMSCs were subcutaneously injected into NOD/SCID mice and animals were sacrificed at 3rd and 12th week respectivelyto observe the formation of tumors to evaluate tumorigenicity of hUCMSCs. t-test was used to compare tumor volumes and tumor weights. The relative tumor inhabitation rate, T/C％, was also calculated. Results The tumor volumes of median and high dose groups were smaller than the control group in WiDr tests at day 43（586.7±274.4）mm3,（689.5±114.8）mm3vs（945.9±234.0）mm3，P ＜ 0.05, but their T/C％ was greater than 40％; the tumor volumes of low-, median- and high-dose groups were smaller than the control group at day 51（777.8±346.7）mm3,（793.1±358.6）mm3,（800.7±116.5）mm3vs（1300.0± 356.8）mm3, P ＜ 0.05, but their T/C％ were greater than 40％; the study indicated that 3 doses of hUCMSCs have no effect on growth of WiDr tumor. The tumor volumes in all doses of hUCMSCs has no significant difference in all the time points compared to the control group in Raji tests (P ＞0.05), indicated that hUCMSCs did not affect tumor growth. Pathological examination showed the same results. No tumor transformation tendency was observed in gross and pathological examination in NOD/SCID mice when hUCMSCs groups of three different passages and MRC-5 negative control group were intravenously injected into NOD/SCID mice. Conclusion The study indicated that the hUCMSCs do not affect growth of WiDr or Raji tumor in nude mice, and hUCMSCs of different passages don't have tumorigenicity in NOD/SCID mice.

Umbilical cord; Mesenchymal stem cell; Tumorigenicity; Tumor enhancement

2016-06-11）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.006

深圳市科技计划项目（JSGG20130917151830203）

518062 深圳，北科生物科技有限公司1；100176 北京，昭衍新药研究中心股份有限公司2

刘沐芸，Email：muyun@beike.cc

前两位作者对本文具有相同贡献，同为第一作者

谢长峰，杜杰，曾桂芳,等.人脐带间充质干细胞对裸鼠的促瘤和致瘤性研究[J/CD].中华细胞与干细胞杂志∶电子版, 2016, 6(6)∶356-362.