不同来源单个核细胞移植对2型糖尿病下肢血管病变的疗效比较

刘璠周慧敏杨爱格李全海闫宝勇周亚茹

·论著·

不同来源单个核细胞移植对2型糖尿病下肢血管病变的疗效比较

刘璠1周慧敏1杨爱格1李全海1闫宝勇1周亚茹2

目的 比较不同来源单个核细胞治疗2型糖尿病（T2DM）下肢血管病变的有效性及安全性。方法 选取河北医科大学第一医院内分泌科T2DM下肢血管病变患者60例，按随机数字表随机分为对照组（n = 20）、骨髓组（n = 20）及脐带血组（n = 20），分别给予生理盐水、自体骨髓单个核细胞、脐带血单个核细胞小腿肌间注射。分别于第0、12、24周评估其有效性及安全性。结果 治疗后，对照组各项指标差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；12周时，骨髓组静息痛评分、肢体冷感评分、麻木评分分别为4.56±1.04，3.67±0.84，2.72±1.07，F = 15.093，20.292，31.463，P均＜ 0.001与脐带血组静息痛评分、肢体冷感评分、麻木评分分别为4.89±0.83，3.44± 0.98，2.50±0.79，F = 26.792，12.967，35.034，P均＜ 0.001，差异具有统计学意义；24周时，骨髓组间歇跛行距离、经皮氧分压、下肢皮肤的温度、静息状态下踝肱压指数分别为（310±65.5）m，（34.89±6.65）mmHg，（32.29±1.33）℃，0.59±0.11，F = 23.938，42.243，22.736，19.971，P均＜0.001与脐带血组间歇跛行距离、经皮氧分压、下肢皮肤的温度、静息状态下踝肱压指数分别为（318±64.9）m，（31.78±5.63）mmHg，（32.83±1.02）℃0.61±0.07，F = 25.726，13.542，38.113，33.510，P 均＜ 0.001，差异具有统计学意义，同时间点两组间差异无统计学意义（P ＞ 0.05），研究过程均无死亡、肿瘤、增殖性视网膜病变病例报告。结论 两种来源单个核细胞小腿肌间注射治疗T2DM下肢血管病变均安全、有效，脐带血单个核细胞的疗效不劣于自体骨髓单个核细胞。

糖尿病，2型； 下肢； 血管病变； 脐血； 骨髓； 单核细胞

与非糖尿病患者群相比，2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）患者发生外周动脉病变的风险是其4倍[1]。糖尿病下肢血管病变者干细胞募集能力下降，晚期糖基化终末产物抑制干细胞的增殖及迁移，新生血管形成受阻、胶原基质形成障碍、感染等多种原因导致缺血或受损组织修复时间延长、难以愈合。目前内科治疗效果欠佳，外科介入治疗以及血管搭桥手术并非适用于所有患者，其成为目前糖尿病慢性并发症治疗的难题之一。随着医学发展，自体骨髓单个核细胞移植成为治疗糖尿病下肢血管病变的新技术。骨髓单个核细胞为原始细胞，在适当的环境下可以分化形成各种细胞[2-4]，进一步形成新生毛细血管，参与重建缺血局部的代偿性血管，改善和恢复下肢血流。目前脐带血单个核细胞亦用于临床治疗T2DM下肢血管病变，因其抗原性弱，故可以进行异体移植，且来源广泛、采集方便。但二者临床疗效有无差异，目前研究较少。本研究分别应用脐带血和自体骨髓单个核细胞治疗T2DM下肢血管病变，比较其有效性及安全性，为其进一步应用提供理论依据。

资料与方法

一、研究对象

从2010年1月至2014年1月就诊于河北医科大学第一医院内分泌科的T2DM下肢血管病变患者中选取60例符合标准的患者进入研究。至研究结束，对照组1例未按要求随诊退出试验，共19例完成试验；骨髓组和脐带血组各2例未按要求随诊退出试验，均有18例完成试验。各组性别、年龄、病程、吸烟史、饮酒史、体质量指数（body mass index，BMI），差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）见表1。骨髓组移植单个核细胞数量为（6.43±2.20）×108，脐带血组移植单个核细胞数量为（5.92±1.73）×108，两组差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。

纳入标准：符合1999年WHO制定的T2DM下肢血管病变诊断，经过内科治疗3个月症状无好转，不适宜外科治疗。排除标准：T2DM伴视网膜病变，1型糖尿病，伴髂动脉闭塞，曾明确诊断或疑有恶性肿瘤，近1年内发生缺血性心、脑血管疾病，不能耐受手术。排除标准：研究期间出现缺血性心、脑血管疾病，未按要求随诊，患者自行要求退出。本试验为一项随机、开放、平行对照临床研究，经医院伦理委员会审批通过。

二、研究方法

60例患者按随机数字表随机分为3组，对照组、骨髓组以及脐带血组，每组20例。所有研究对象在研究期间均根据病情采用内科综合治疗，包括严格控制血糖、血脂、血压，戒烟，溃疡清创、局部换药治疗等。

表1 各组基线指标的比较

1.一般资料：记录患者年龄、吸烟和饮酒情况以及病程，测BMI；第0、12、24周研究对象测收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP），患者空腹（隔夜10 ～ 12 h）采静脉血测定空腹血糖（fasting blood-glucose，FPG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）以及总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）。

2.自体骨髓单个核细胞的制备：患者在无菌条件下局麻后从髂后上嵴处抽取自体骨髓150 ～ 200 ml，由我院细胞室制备成50 ml单个核细胞悬浊液备用。

脐带血单个核细胞的制备：由我院产科在征得产妇同意后，无菌收集自然分娩后脐带内的残余血，肝素抗凝，送细胞室分离、制备成50 ml单个核细胞混悬液备用。

3.移植方法：完善术前检查后行移植治疗骨髓组和脐带血组在手术室静脉复合麻醉下分别给予骨髓单个核细胞和脐带血单个核细胞小腿肌肉注射。将采集的单个核细胞混悬液进行肌肉注射，1 ml/针，每针间距1.5 cm×1.5 cm，溃疡周围每针间距1 cm×1 cm。无菌敷料包扎，保暖垫保温，术后3天拆除敷料。对照组给予生理盐水小腿肌肉注射，方法同其他两组。

三、结果评估

1.有效性指标：第0、12、24周对研究对象的主观及客观指标进行评价。主观指标包括静息痛评分、肢体冷感评分和麻木评分，根据程度不同分为10个等级（共10分，分数越高程度越重）。客观指标包括间歇跛行距离、经皮氧分压、下肢皮肤的温度、静息状态下踝肱压指数。

2.安全性指标：了解移植治疗后有无其他并发症以及合并症的发生，第12、24周研究对象查胸部CT、肝、胆、胰、脾、肾、膀胱彩超、肝功能及肾功能（Beckman LX20全自动生化分析仪）及眼底检查，均由专人操作。

四、统计学分析方法

应用SPSS 19.0统计软件处理统计数据，各组年龄、病程、BMI、SBP、DBP、HbA1c、FBG、TG、TC、LDL-C及各项主观指标和客观指标正态分布通过± s表示，各组年龄、病程、BMI比较采用单因素方差分析，各组治疗前后SBP、DBP、HbA1c、FBG、TG、TC、LDL-C及各项主观指标和客观指标比较采用协方差分析；性别、吸烟史、饮酒史比较应用χ2检验。以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

表2 各组治疗前后血压、血糖、血脂的比较（± s）

表2 各组治疗前后血压、血糖、血脂的比较（± s）

注：FPG：空腹血糖；HbA1c：糖化血红蛋白；SBP：收缩压；DBP：舒张压；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

组别时点（周）例数FPG（mmo/L）HbA1c（％）SBP（mmHg）DBP（mmHg）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）对照组 0197.30±0.616.84±0.48136±7.072±8.01.69±0.295.20±0.483.88±0.63 12197.31±0.516.83±0.53133±4.771±3.71.73±0.355.16±0.313.85±0.48 24197.47±0.736.86±0.42135±4.972±4.71.72±0.365.16±0.443.76±0.61 F值0.4640.0210.8400.2310.0930.0690.201 P值0.6310.9790.4370.7940.9110.9340.818骨髓组 0187.30±0.626.85±0.71136±4.672±8.01.66±0.255.19±0.353.95±0.47 12187.27±0.416.84±0.49134±5.471±6.61.68±0.285.14±0.413.81±0.47 24187.43±0.696.92±0.40134±6.474±5.51.67±0.385.20±0.463.78±0.46 F值0.5220.3740.5720.8980.5180.0760.785 P值0.5960.6900.5680.4140.5990.9270.461脐带血组 0187.24±0.617.03±0.64134±5.873±5.01.86±0.465.24±0.453.69±0.62 12187.31±0.466.91±0.48133±4.773±5.01.80±0.255.08±0.373.50±0.42 24187.25±0.787.09±0.36132±3.272±4.11.88±0.415.11±0.363.52±0.53 F值0.0550.8740.5450.0190.6890.9780.600 P值0.9460.4230.5830.9810.5070.3830.552

一、各组一般情况比较

各组SBP、DBP、HbA1c、FBG、TG、TC、LDL-C治疗前后均无显著变化（P ＞ 0.05，表2）。

二、有效性评价

治疗后，对照组各项指标差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）；骨髓组及脐带血组12周时主观指标均逐步降低（P ＜ 0.01），24周客观指标显著改善（P ＜0.01）；与对照组相比，12周时骨髓组及脐带血组主观指标均显著低于对照组（P ＜ 0.01），24周时两组主观指标均显著低于对照组（P ＜ 0.01），客观指标均显著高于对照组（P ＜ 0.01）同时间点两组间差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。（表3）

三、安全性评价

研究过程中各组肝功能、肾功能均未见异常，均无死亡、肿瘤、增殖性视网膜病变病例报告。

表3 各组治疗前后有效性指标的比较（± s）

表3 各组治疗前后有效性指标的比较（± s）

注：TcPO2为经皮氧分压，与同组0周相比，aP ＜ 0.01；与同组第12周相比，bP ＜ 0.01；与同时间对照组相比，cP ＜ 0.01；与同时间骨髓组相比，dP ＜0.01

组别时点（周）例数静息痛评分肢体冷感评分麻木评分间歇跛行距离（m）下肢皮肤温度（℃）TcPO2（mmHg）ABI对照组 0196.05±1.474.68±1.204.68±0.82185±44.929.87±1.5220.37±5.670.38±0.12 12195.89±1.204.58±1.074.53±0.77184±38.929.78±1.1120.26±5.050.36±0.08 24196.21±1.185.26±1.324.47±1.12180±38.129.67±1.2618.58±4.690.38±0.08 F值0.2851.7760.2700.0910.1170.7190.236 P值0.7530.1790.7640.9130.8900.4920.790骨髓干细胞组 0185.89±1.495.28±1.364.39±1.20187±50.730.18±1.3320.06±5.240.39±0.11 1218 4.56±1.04ac3.67±0.84ac2.72±1.07ac205±55.728.96±7.2720.28±4.550.41±0.10 2418 3.78±0.87ac2.94±1.11ac1.78±0.65abc310±65.5abc32.29±1.33bc34.89±6.65abc0.59±0.11abcF值15.09320.29231.46323.93822.73642.24319.971 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000脐带血干细胞组 0186.17±1.154.83±1.824.22±0.73192±51.129.74±1.1823.06±5.790.36±0.11 1218 4.89±0.83ac3.44±0.98ac2.50±0.79ac212±52.730.17±1.2423.33±5.730.42±0.09 2418 3.83±0.86abc2.61±0.97ac2.00±0.97ac318±64.9abc32.83±1.02bc31.78±5.63abc0.61±0.07abcF值 26.792 12.967 35.034 25.726 38.113 13.542 33.510 P值＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

讨 论

动物及临床研究证实骨髓干细胞治疗是改善下肢组织血供的有效手段[5-8]。但实际工作中部分患者无法进行自身骨髓采集而影响其临床应用。目前发现脐带血含丰富干细胞，资源丰富、成本低廉，已经成为公认的干细胞重要来源之一。张弛等[9]研究显示大鼠缺血下肢局部移植脐带血单个核细胞安全、有效；研究进一步发现脐带血干细胞组移植下肢血管内皮生长因子含量、毛细血管密度与骨髓干细胞组比较无显著差异，提示脐带血干细胞移植改善糖尿病大鼠下肢缺血的疗效可达到骨髓干细胞移植的效果。Park等[10]研究证实脐带血干细胞可促进细胞增殖、血管新生。此外，其可能具有一定旁分泌功能，进一步促进皮肤创伤修复、改善缺血，提高保肢率[11]。

本研究显示骨髓组及脐带血组患者主观指标、客观指标均显著改善，研究过程中两组均无死亡、肿瘤、增殖性视网膜病变病例报告，提示自体骨髓单个核细胞及脐带血单个核细胞小腿肌间注射治疗T2DM下肢血管病变均安全、有效，与文献报道一致。本研究进一步发现，单个核细胞移植治疗3个月后患者主观症状改善，早于客观指标的改善（移植治疗后6个月）。此外同时间点骨髓组与脐带血组在主观、客观评价指标方面差异均无统计学意义，提示脐带血单个核细胞与自体骨髓单个核细胞小腿肌间注射治疗T2DM下肢血管病变的疗效差异无统计学意义。

本研究结果表明脐带血单个核细胞与自体骨髓单个核细胞小腿肌间注射治疗T2DM下肢血管病变的疗效相同。但本组资料来源于单中心，样本量较小、观察时间相对较短，有待日后多中心、大样本、长期的临床研究进一步证实。

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11 Kim JY, Song SH, Kim KL, et al. Human cord blood-derived endothelial progenitor cells and their conditioned media exhibit therapeutic equivalence for diabetic wound healing[J]. Cell Transplant, 2010, 19(12)∶1635-1644.

Efficacy and safety of injection of different mononuclear cells between calf muscles for lowerextremity arterial disease of type 2 diabetes

Liu Fan1, Zhou Huimin1, Yang Aige1, Li Quanhai1, Yan Baoyong1, Zhou Yaru2.1Department of Endocrinology, The First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, China;2Department of Endocrinology, The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China

Zhou Huimin, Email:liufan8130@sina.com

Objective To compare the efficacy and safety of injection of different mononuclear cells for lower-extremity arterial disease（LEAD）of type 2 diabetes（T2DM）. Methods 60 patients with LEAD of T2DM were randomized into control group（n = 20）, umbilical cord blood group（UCB group, n = 20）and autologous bone marrow group（ABM group, n = 20）, wwhile normal saline, umbilical cord blood stem cell and autologous bone marrow mononuclear cells were respectively injected between the calf muscles of them. The subjective and objective responses were measured at week 0, 12 and 24, while safety was evaluated as well. Results There were no significantly change of the subjective and objective outcomes in the control group during the study（P ＞ 0.05）. At week 12, scores of rest pain, cold feeling and numbness were 4.56±1.04 （F = 15.093, P ＜ 0.001 vs control）, 3.67±0.84（F = 20.292, P ＜ 0.001 vs control）and 2.72±1.07（F = 31.463, P ＜ 0.001 vs control）respectively in the ABM group, and 4.89±0.83（F = 26.792, P ＜ 0.001 vs control）, 3.44±0.98（F = 12.967, P ＜ 0.001 vs control）and 2.50±0.79（F = 35.034, P ＜ 0.001 vs control）respectively in the UCB group, which were significantly improvedcompared to the control. At week 24, intermittent limp distance, transcutaneous oxygen pressure, skin temperature of lower limb and ankle brachial pressure indices were（310±65.5）m（F = 23.938, P ＜0.001 vs control）,（34.89±6.65)mmHg（F = 42.243, P ＜ 0.001 vs control）,（32.29±1.33）℃（F = 22.736, P ＜ 0.001 vs control）and 0.59±0.11（F = 19.971, P ＜ 0.001 vs control）respectively in the ABM group, and（318±64.9）m（F = 25.726, P ＜ 0.001 vs control）,（31.78±5.63）mmHg（F = 13.542, P ＜ 0.001 vs control）,（32.83±1.02）℃（F = 38.113, P ＜ 0.001 vs control）and 0.61±0.07（F = 33.510, P ＜ 0.001 vs control）respectively in UCB group, which were significantly improved too. There were no significant difference between two groups at the same points（P ＞ 0.05）. During the study no case of death, tumor and hyperplastic retinopathy was reporded. Conclusion Injection of different mononuclear cells between the calf muscles were similarly effective and safe for LEAD of T2DM.

Diabetes mellitus, type 2； Lower-extremity； Arterial disease； Cord blood ； Bone marrow monocytes

2016-07-27）

（本文编辑：陈媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.005

河北省科学技术研究与发展计划项目（12276102D）

050031 石家庄，河北医科大学第一医院内分泌科1；050000 石家庄，河北医科大学第三医院内分泌科2

周慧敏，Email：liufan8130@sina.com

刘璠，周慧敏，杨爱格，等. 不同来源单个核细胞移植对2型糖尿病下肢血管病变的疗效比较[J/CD].中华细胞与干细胞杂志∶电子版, 2016, 6(6)∶351-355.