靶向沉默动脉粥样硬化患者巨噬细胞中Notch基因对NF-κB经典通路的影响

李伟 朱莉 阮中宝 任寅 王斌

·论著·

靶向沉默动脉粥样硬化患者巨噬细胞中Notch基因对NF-κB经典通路的影响

李伟 朱莉 阮中宝 任寅 王斌

目的 探讨Notch和NF-κB信号通路在动脉粥样硬化（AS）发病过程中的作用方式、两者是否存在串话。方法 将AS患者外周血单核细胞诱导为巨噬细胞后，分别经Notch1-siRNA、Notch2-siRNA、Notch3-siRNA以及NC-siRNA转染。使用RT-PCR和Western Blot法检测转染后各组P65、IκBα基因以及蛋白表达情况。EMSA法检测转染后各组NF-κB活性。免疫荧光法检测巨噬细胞内P65分布。两组间资料差异比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果 RT-PCR结果显示，siRNA转染巨噬细胞后，Notch3-siRNA组、Notch2-siRNA组、Notch1-siRNA组中P65基因表达水平渐次降低（分别为0.709±0.007、0.557±0.031、0.114± 0.014），组间差异有统计学意义（F = 709.224，P ＜ 0.001），且较空白及阴性对照组均出现明显下降（P ＜ 0.05），Noch1-siRNA组下降最显著；而IκBα表达水平渐次升高（分别为1.811±0.172、3.253±0.169、5.295±0.433），组间差异有统计学意义（F = 112.290，P ＜ 0.001），并均明显高于空白、阴性对照组（P ＜ 0.05），也以Noch1-siRNA组变化最明显。Western-Blot方法检测所得P65、IκBα蛋白表达结果与RT-PCR结果一致。Notch-siRNA转染后的巨噬细胞内NF-κB活性均显著低于空白对照组和阴性对照组，Notch1-siRNA组活性下降最显著。巨噬细胞核内及胞浆内P65蛋白的荧光强度Notch1-siRNA组（21 405.20±929.91）、Notch2- siRNA组（25 987.13± 911.40）、Notch3-siRNA组（28 074.67±452.16）较空白对照组（57 238.33±1 059.21）以及阴性对照组（55 844.27±1331.10）均不同程度减弱（P均＜ 0.01），且细胞核内荧光强度较核外更低，以Notch1-siRNA组减弱最明显（组间比较F = 55.137，P ＜ 0.001）。结论 AS患者巨噬细胞中Notch与NF-κB经典通路之间存在正向调节，且Notch1通路较Notch2、Notch3对NF-κB经典通路的调节作用更显著。

Notch； NF-κB； 基因表达； 动脉粥样硬化； 巨噬细胞

心血管疾病是长期困扰人类健康的恶性疾病之一，其中动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发病率逐年上升，已成为老年死亡的重要原因。近年来认为AS是一种炎性免疫性疾病，其始动环节为天然免疫反应的激活，而在天然免疫反应过程中巨噬细胞起着极其重要的作用[1-2]。大量深入的研究提示NF-κB信号通路参与AS发病。作为炎症反应的关键性转录因子NF-κB广泛参与了免疫炎症反应、细胞凋亡以及增殖的调控，控制着AS形成中起关键作用的多种基因转录[3]。Notch信号通路是目前发现的参与细胞增殖、分化以及凋亡的一类十分重要的信号家族，广泛表达于各类免疫细胞表面[4]。通过Notch信号通路在巨噬细胞中的表达，研究者推测其可能与AS存在相关性，且已在研究中得到部分证实[5-6]，但是到目前为止并没有统一的结论。已有研究显示，在其他细胞中NF-κB与Notch信号通路存在一定串话关系[7-10]，但两者在巨噬细胞诱导AS过程中是否存在联系及如何联系尚不明确。Notch信号通路是否与NF-κB“经典”或“非经典”通路之间存在影响有待进一步研究明确。本研究旨在探索Notch和NF-κB信号通路在AS发病过程中的作用方式、两者是否存在影响，从而为AS防治提供理论基础和依据。

材料与方法

一、主要实验材料与试剂

Notch1、2、3-siRNA购自上海吉玛制药有限公司，Lipofectamine 2000、RNA提取试剂Trizol以及GAPDH、IκBα、P65的引物均购自美国Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒来自美国Thermo Fisher公司，引物经南京凯基生物公司合成。免疫印迹实验中核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒，P65、IκBα的一抗，ECL检测试剂盒以及二抗（羊抗兔IgG）均购自泰州市百英生物公司。凝胶阻滞分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）检测试剂盒、疫荧光实验中试剂盒亦购自泰州市百英生物科技有限公司，P65抗体购自南京凯基生物公司。

二、方法

（一）单核细胞诱导为巨噬细胞

采集经冠脉造影检查明确为AS的3例患者外周静脉血各20 ml并使用肝素抗凝。将所采集静脉血与等体积磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）混匀，按1∶1体积比加入至淋巴细胞分离液，离心出静脉血中单核细胞。再经PBS洗涤后加入到含100 ml/L 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI 1640培养基中经37 ℃、50 ml/L CO2培养箱孵育，每隔24 ～ 48 h按悬浮细胞传代方法1∶2 ～ 1∶3传代1次，最后选取3 ～ 5代的细胞按（0.5 ～1.0）×106/ml的细胞密度接种于6孔板中，加入浓度为100 ng/ml的佛波醇酯（phorbol ester，PMA）刺激24 ～ 48 h，细胞由悬浮转为贴壁，体积增大，形状转为梭形、椭圆形或伸出伪足，说明已诱导为巨噬细胞。实验前将巨噬细胞细胞置入RPMI1640培养基孵育12 h，确保实验时其处于静止状态。

（二）Notch-siRNA转染巨噬细胞

接种静止状态的巨噬细胞至细胞培养板，每孔加入不含抗生素的培养基，确保转染的细胞密度达到30％～ 50％。用250 μl无血清培养基Opti-MEM分别稀释5 μl的siRNA贮存液，混匀后室温孵育5 min。同时用250 μl Opti-MEM稀释5 μl脂质体2 000（lipo 2 000），混匀后室温孵育5 min。将上述2种液体合并混匀，室温下孵育20 min后加入含有巨噬细胞的培养孔中，轻轻混匀。培养4 ～ 6 h后重新更换培养基。随后将培养板置于37℃、50 ml/L CO2培养箱孵育24，48，72 h后收样，待行各项检测。实验设置Notch-1 siRNA组、Notch-2 siRNA组、Notch-3 siRNA组、阴性对照组以及空白对照组，每组设置3个重复。（siRNA及阴性对照引物序列见表1）

（三）RT-PCR法检测转染组NF-κB信号通路关键基因P65、IκBα的表达

使用Trizol试剂盒提取转染后各组细胞总RNA，按说明书配成逆转录体系，在PCR扩增仪上孵育得到cDNA产物。以cDNA第—链为模板，进行PCR反应（反应引物序列见表2）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外成像并扫描分析，将目的基因PCR产物分析值与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）扫描值相比，所得比值表示mRNA的表达水平。

表1 引物组序列

表2 IκBα、P65以及GAPDH的引物序列

（四）Western-blot方法检测各组NF-κB信号通路中IκBα、P65蛋白的表达

收集完各组细胞后，加入100 μl预冷的细胞裂解液冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，按照Lowry法行蛋白定量。常规制胶、上样后进行SDS-PAGE电泳，然后将相关的蛋白质区带转印到PVDF膜上，与一抗（抗IκBα、抗P65）和二抗（羊抗兔 IgG）反应。经ECL化学发光试剂显色后使用BOX ChemiXR5成像，计算机软件处理分析。实验以GAPDH作为内参。

（五）EMSA方法检测NF-κB活性

使用核蛋白提取试剂盒提取巨噬细胞核蛋白，并行蛋白定量。依次加入超纯水5 μl、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）2 μl、细胞核蛋白2 μl共浴10 min后，加入标记好的NF-κB寡核苷酸探针（序列为5'-TCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3'，末端加γ-[³²P]ATP标记）1 μl至总体积10 μl，共浴20 min后，6.5％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用BOX chemiXR5凝胶成像系统成像，最后用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

（六）免疫荧光法检测细胞内P65分布

自然晾干细胞样本，经4％多聚甲醛固定后行抗原修复、3％H2O2-甲醇溶液灭活酶，滴加即用型山羊血清温室孵育20 min。加入1％牛血清白蛋白溶液（BSA）稀释的鼠抗人P65一抗100 μl，37℃湿盒孵育2 h，PBS浸洗3次。加用1％BSA稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记山羊抗小鼠IgG 100 μl，37 ℃避光孵育1 h。DAPI染细胞核后封片，荧光显微镜下测定细胞内荧光强度，取3个高表达区域照相留存。

三、统计学分析方法

使用统计学软件SPSS 13.0进行统计分析，沉默巨噬细胞Notch1、2、3受体后所测得的RT-PCR、Western-bolt以及免疫荧光用± s表示，两组间资料差异比较采用t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析。以P ＜ 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

表3 转染后各组Notch基因的表达（n = 3± s）

表3 转染后各组Notch基因的表达（n = 3± s）

分组Notch1Notch2Notch3阴性对照组1.021±0.2451.175±0.1201.021±0.129转染组0.133±0.0260.177±0.0040.130±0.013 t 值 55.067 14.384 11.866 P值＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

一、沉默效果观察

分别转染Notch1、2、3 siRNA以及NC-siRNA 48 h后对各组细胞Notch基因进行RT-PCR检测（结果见表3），与阴性对照组比较，3组抑制率分别为（86.930±1.418）％、（84.818±1.560）％、（87.275± 0.372）％，沉默效果满意，可用于后续实验。（表3）

二、RT-PCR法检测NF-κB通路中P65、IκBα基因的表达

结果显示，空白对照组与阴性对照组比较，P65、IκBα基因表达水平差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。Notch3-siRNA组、Notch2-siRNA组、Notch1-siRNA组中P65表达水平渐次降低，组间差异有统计学意义（P ＜ 0.01），且较空白及阴性对照组均出现明显下降（P ＜ 0.05），Notch1-siRNA组下降最显著。而IκBα表达水平渐次升高，组间差异有统计学意义（P均＜ 0.01），并均明显高于空白、阴性对照组（P ＜0.05），Notch1-siRNA组上升最显著。（表4）

表4 P65、IκBα在各组细胞中的表达（n = 3，± s）

表4 P65、IκBα在各组细胞中的表达（n = 3，± s）

注：与空白对照组比较，aP ＜ 0.05；与阴性对照组比较，bP ＜ 0.05；与Notch1-siRNA组比较，cP ＜ 0.05；与Notch2-siRNA组比较，dP ＜ 0.05

分组P65IκBα空白对照组1.004±0.1051.003±0.087阴性对照组1.043±0.0961.027±0.052 Notch1-siRNA组 0.114±0.014ab5.295±0.433abNotch2-siRNA组 0.557±0.031abc3.253±0.169abcNotch3-siRNA组 0.709±0.007abcd1.811±0.172abcdF值122.149194.338 P值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

三、Western Blot检测各组巨噬细胞中P65、IκBα蛋白的表达

结果与RT-PCR一致，NF-κB通路的关键亚基蛋白P65表达水平较空白、阴性对照组均显著下降[分别为（16.882±0.842）％、（27.961± 0.227）％、（34.992±0.421）％比（44.153±0.394）％、（44.715 ±1.074）％，t = 77.556、77.610、99.634、43.453、31.092、14.651，P均＜ 0.01]，且在Notch3、2、1-siRNA各组中依次下降，组间差异有统计学意义（F = 800.178，P ＜ 0.01）。IκBα蛋白表达较空白、阴性对照组显著升高[分别为（64.534±2.603）％、（48.919±0.631）％、（28.919±0.553）％比（3.239± 1.144）％、（22.508±0.317）％，P = 0.000、0.000、0.023、0.000、0.000、0.002]，且在Notch3、2、1-siRNA各组中渐次升高，组间差异有统计学意义（F = 387.853，P ＜ 0.01）。沉默Noch1对P65、IκBα蛋白表达水平影响最明显。（图1）

四、EMSA检测沉默Notch1、2、3基因对NF-κB活性的影响

结果显示，巨噬细胞转染Notch3、2、1-siRNA后各组NF-κB活性均显著低于空白对照组和阴性对照组，且呈渐次下降，Notch1-siRNA组的活性下降最显著。（图2）

图1 各组P65、IκBα蛋白表达水平的Western Bolt检测结果

图2 NF-κB在各组中的DNA结合活性

五、免疫荧光法检测巨噬细胞内P65分布

Notch1、2、3受体基因分别受到沉默后，巨噬细胞核内及胞浆内P65蛋白的荧光强度（分别为Notch1-siRNA组21405.20±929.91、Notch2-siRNA组25987.13±911.40、Notch3-siRNA组28074.67± 452.16）较空白对照组（57238.33±1059.21）以及阴性对照组（55844.27±1331.10）均不同程度减弱（t = 44.033、28.737、43.860、36.736、32.056、34.214，P均＜0.01；n = 3)，且细胞核内荧光强度较核外更低，以上变化以Notch1-siRNA组最明显，组间差异有统计学意义（F = 55.137，P ＜ 0.001）。（图3）

图3 生物荧光倒置显微镜下观察沉默巨噬细胞中Notch受体后p65亚基定位分布情况 （DAPI染色×400）

讨 论

Notch与NF-κB信号通路在AS发病过程中均起着重要的调控作用，但前者对后者是否存在影响及可能存在的影响机制尚不明确。Notch信号通路包括Notch受体、配体、细胞内效应器分子以及Notch的调节分子等。哺乳动物中Notch受体包括Notch1-4，Notch配体包括Jagged1、Jagged2和DLL1，3，4[12]。Notch配体与受体相互作用后，释放胞内活性结构（NICD）入胞质，并进入细胞核与转录因子CSL结合，形成转录激活复合体，从而活化下游靶基因，发挥生物学作用。鉴于Notch信号通路中研究较多的是Notch1、2、3受体，本课题根据这三者间的同源保守序列设计siRNA序列，并成功转染巨噬细胞，分别沉默细胞中Notch1、2、3基因，构建Notch低表达的AS患者外周血单核－巨噬细胞模型，在上述siRNA转染后的巨噬细胞中采用荧光定量RT-PCR、Western Blot、EMSA、免疫荧光等技术检测NF-κB信号通路中关键基因以及蛋白的表达变化。

siRNA转染巨噬细胞后，Notch3-siRNA组、Notch2-siRNA组、Notch1-siRNA组中P65基因及蛋白表达水平渐次降低，Noch1-siRNA组下降最显著。而IκBα表达水平渐次升高，也以Noch1-siRNA组变化最明显。Notch信号通路被阻断后，各组NF-κB的结合活性均出现显著降低，同样以Notch1 siRNA组降低最明显。激光共聚焦显微镜下可看出，AS患者巨噬细胞中转染siRNA后，细胞核以及胞浆中P65蛋白的表达出现减弱，以核内表达减弱相对较明显。以上结果表明，Notch信号通道受到抑制后，可以在转录水平下调NF-κB功能亚基P65的表达，上调NF-κB抑制因子IκBα的表达，抑制P65蛋白向核内转移，同时还降低核蛋白NF-κB的DNA结合活性，从而影响下游基因的转录活性，最终导致NF-κB信号通路受到抑制。Notch1受体基因阻断后对NF-κB通路活性的影响较其他两种受体（Notch2、3）更为显著。

近年来研究显示，Notch与NF-κB两个信号通路之间的串话关系、机制非常复杂，有正向调节，也有负向调节，其作用机制与细胞类型有关。例如在骨髓造血干细胞中，Notch1可通过上调P50、P56、RelB和c-Rl的表达，以激活NF-κB信号通路[11]，而在人宫颈癌HeLa细胞中，Notch1下调P50的表达，增加细胞质中IκB的表达，抑制NF-κB通路活性[13]。本研究显示，在AS患者巨噬细胞中Notch信号通路对NF-κB信号通路具有正向调节作用。笔者推测Notch基因被沉默后，其细胞内活性结构NICD的表达可能受到抑制，进而介导下游NF-κB通路失活。现研究已得出在其他细胞中，NICD可以通过细胞内效应器分子CSL介导或直接与NF-κB亚基结合而影响NF-κB通道活性。如某些CSL反应元件对P100启动子具有转录激活作用。Notch与特定的CSL反应元件结合后，可将其激活为转录因子，进而增加P100（P52前体）的表达，并最终导致NF-κB通路的激活[14]。NICD还可与IKK信号复合体作用，启动其降解IκBα的激酶活性，进而激活经典NF-κB信号途径[7]。巨噬细胞中可能也存在类似激活机制，当NICD受抑制后，无法促进NF-κB通路中IκBα的降解以及上调P65的表达。正常情况下，在NF-κB信号通路中IκB与其功能亚基（如P65、P52）结合，使其处于细胞质中，抑制其转位到细胞核内而发挥作用。同时IκB还能将NF-κB由细胞核输出至细胞质，以阻断其DNA活性[15]。当Notch通路阻断后，一方面NF-κB通路中IκBα表达上调，导致P65蛋白处于结合状态，难以释放入核；另一方面P65从转录水平受到下调，导致P65蛋白表达量下降，入核进一步减少，活性下降。几方面共同作用，抑制NF-κB经典信号通路启动[16]，从而使其下游一系列基因的表达受到负向调节，阻止炎症、免疫反应启动。

综上所述，本研究初步揭示了在AS患者巨噬细胞中，Notch和NF-κB经典信号通路之间具有正向调节关系，且Notch1较Notch2、3对NF-κB信号通路的调节作用更显著。本研究结果目前国内未见报道，为AS治疗提供新的思路和理论基础。然而，两者之间具体调节机制仍有待进一步的探究。

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Effects of silencing Notch genes on NF-κB classic pathway in macrophages of patients with atherosclerosis

Li Wei, Zhu Li, Ruan Zhongbao, Ren Yin, Wang Bin. Department of Cardiology, Taizhou People's Hospital, Taizhou 225300, China

Zhu Li, Email:tzheart@126.com

Objective To investigate the mechanism and crosstalk between Notch and NF-κB signaling pathway in macrophages of patients with atherosclerosis (AS). Methods The mononuclear cells from peripheral blood of patients with AS were induced into macrophages, which were then silenced by Notch1-siRNA, Notch2-siRNA, Notch3-siRNA and NC-siRNA. RT-PCR and Western blot were applied to assess the expression levels of P65 and IκBα in the NF-κB signaling pathway. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to observe the NF-κB DNA binding activity. Subcellular distributions of P65 was detected with immunofluorescence. t test was used to compare the difference of data between two groups. One-way analysis of variance was used to compare the difference among groups. Results RT-PCR results showed that, after Notch-siRNA being transfected into macrophages, the expression of P65 declined in the Notch-3 siRNA group(0.709±0.007), the Notch-2 siRNA group (0.557±0.031), and the Notch-1siRNA group (0.114± 0.014) (P ＜ 0.01), all of which were lower than the control (1.004±0.105) group and the negative control group (1.043±0.096) (P ＜ 0.05).The expression of IκBα (1.811±0.172, 3.253± 0.169, 5.295±0.433) increased (P ＜ 0.01), all of which were greater than the control (1.003±0.087) group and the negative control group (1.027±0.052) (P ＜ 0.05), especially in Notch1-siRNA group. The results of Western Blot were in accordance with those of RT-PCR. The NF-κB DNA binding activity were inhibited. The fluorescence intensity of P65 decreased both in the nucleus and cytoplasm compared to the control group and the negative control group (P ＜ 0.01), which declined more obviously in the nucleus. Conclusions A positive relationship may exist between Notch signaling pathway and NF-κB classic pathway in the macrophages of patients with AS. Notch1 pathway may play a more important role in the regulation on NF-κB signaling pathway than Notch2 and Notch 3.

Notch； NF-κB； Gene expression； Atherosclerosis(AS) Macrophages

2016-02-18）

（本文编辑：蔡晓珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.001

泰州市社会发展基金（81570748）

225300 泰州，扬州大学附属泰州市人民医院胸痛中心

朱莉，Email：tzheart@126.com

李伟，朱莉，阮中宝，等. 靶向沉默动脉粥样硬化患者巨噬细胞中Notch基因对NF-κB经典通路的影响[J/CD].中华细胞与干细胞杂志∶电子版, 2016, 6(6)∶327-333.