野生二粒小麦后代LMW-GS编码基因克隆与序列分析

曹　前

（四川省仪陇县农牧业局，南充　　637600）



野生二粒小麦后代LMW-GS编码基因克隆与序列分析

曹前

（四川省仪陇县农牧业局，南充637600）

通过PCR扩增的方法，从稳定遗传的野生二粒小麦高世代后代中分离低分子量谷蛋白基因。并且对核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析，以期为探索SNPs变异在遗传育种中的特性提供参考，为实现分子层面小麦品质育种奠定理论基础。

小麦 低分子量谷蛋白 基因克隆 序列分析

野生二粒小麦具有高蛋白质含量、丰富的贮藏蛋白组成等优良性状，是被期望为全球小麦的可持续生产贡献其全方位多样性的优异物种［1］。然而，遗憾的是，其丰富的遗传多样性在普通小麦种已被降低达70%左右［2］。该研究旨在对野生二粒小麦为父本，栽培小麦为母本的远缘杂种高世代，进行LMW-GS基因的分子克隆和序列分析，探讨野生二粒小麦LMW-GS基因向普通小麦的导入与表达能力，筛选具有含有野生二粒小麦LMW-GS的遗传种质。

1 材料和方法

1.1 材料

（川农16×野生二粒小麦D97）F11的2 n=42的稳定株系7-40、7-209；（川农16×野生二粒小麦D97）F11与內麦9号杂交F2 的株系Q-F2系列；并以亲本川农16为对照。

1.2 方法

采用改进2×CTAB方法对小麦叶片进行基因组DNA提取［3］。运用基因组DNA的PCR扩增、转化、克隆，最后进行测序分析。

2 结果与分析

2.1 LMW-GS基因核酸推导与氨基酸序列分析

保守的N-端区，其基本组成如METSCIPGL，其中SCIPGL部分突变率较高，其决定了小麦LMW-GS属于何种类型，所克隆的基因序列绝大多数为LMW-m型，包括亚基型有SCIPGL，SCISGL，PCIPGL，PCHPWL，SHIPSL，SRVPGL等6种， 其 中PCHPWL，SHIPSL，SRVPGL极其罕见；LMW-i型亚基出现1次，未见LMW-s型亚基。从而推导这3种类型的LMW-GS谷蛋白亚基在小麦中的分布极不均衡。

重复区较长，多肽类型较为丰富，重复区不含半胱氨酸。所克隆LMW-GS序列的重复区都富含脯氨酸（P）和谷氨酰胺（Q），其主要重复片段有QQFPQQ、QQQPLFQQ、QQPFSQQQ、QQPPFSQQQ、QQPPFLQQQ、PPFSQQQQ、QQQPSFSQQ、PLFSQQQQ等重复单元；该区域的变异程度较高，主要由于重复单元数量不同所致，这也决定了LMW-GS基因长度的变异。

2.2 LMW-GS半胱氨酸残基（Cys）的数目及位置

LMW-GS家族成员半胱氨酸残基（Cys）相对保守，一般在8个左右。该研究通过分析LMW-GS蛋白质编码序列，发现该26个基因中半胱氨酸残基（Cys）特异性变异出现了6个不同位置共15次由其它氨基酸替换为半胱氨酸（Cys）。发现了6条具有额外半胱氨酸残基（Cys），具有9个半胱氨酸（残基Cys）的亚基序列；同时发现2条半胱氨酸残基（Cys）缺失型亚基序列，来自母本CN16，其Cys残基缺失了1个。

所获得的LMW-GS氨基酸序列中，半胱氨酸残基（Cys）变异在N-端相对较少，只出现了2个半胱氨酸残基（Cys）被替换的序列；而大部分变异出现在信号肽区和C-端。其中，在信号肽区出现了6个半胱氨酸残（Cys）基替换其他氨基酸的序列。C-端最为丰富，主要表现为半胱氨酸（Cys）替换其他氨基酸，如半胱氨酸（Cys）替换甲硫氨酸（M）2个、半胱氨酸（Cys）替换精氨酸（R）2个、半胱氨酸（Cys）替换甘氨酸（G）3个。

3 讨论

半胱氨酸残基（Cys）变异对小麦品质影响的可能性推测，该研究克隆出的氨基酸序列中，6个LMW－m型氨基酸序列信号肽区第16位为半胱氨酸（C），其余序列为色氨酸（S），其变异极为罕见；在N－端也出现了半胱氨酸（C）向组氨酸（H）和精氨酸（R）的稀有突变；从氨基酸极性和亲水性分析虽不影响信号肽的性质，但不能排除Cys残基在氨基酸聚合时二硫键可能会对蛋白质二级结构起改变作用，从而影响蛋白质构造，进而可能影响小麦的品质。

［1］ gianibelli M C，Larroque O R，MacRichie F，Wrigley C W. Biochemical，genetic，and molecular characterization of wheatglutenin and its component subunits. Cereal Chemstry，2001，（78）：635～646

［2］ Jaradat A. Ecogeography，genetic diversity，and breeding value of wild emmer wheat（Triticum dicoccoides Körn ex Asch. & Graebn.）Thell. Australian Journal of Crop Science，2011，5，（9）：1 072～1 086

［3］ 颜泽洪. 山羊草属物种高分子量谷蛋白基因的分子克隆. 四川农业大学博士论文，2001