α7神经型尼古丁受体基因抑制对SH-SY5Y细胞Tau和配对螺旋样纤维蛋白1水平的影响

周 飞 张淑丽 李 毅 王 凡 官志忠 齐晓岚

(贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

·基础研究·

α7神经型尼古丁受体基因抑制对SH-SY5Y细胞Tau和配对螺旋样纤维蛋白1水平的影响

周 飞 张淑丽 李 毅 王 凡1官志忠 齐晓岚

(贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004)

目的探讨α7神经型尼古丁受体 (nAChR) 基因沉默对SH-SY5Y细胞Tau和配对螺旋样纤维蛋白(PHF)1水平的影响及α7 nAChR在阿尔茨海默病 (AD) 发病机制中的作用。方法 SH-SY5Y细胞转染α7 nAChR shRNA重组质粒，用实时荧光定量PCR和Western印迹法分别测定细胞中α7 nAChR在mRNA和蛋白表达水平的变化；用Western印迹法检测细胞Tau和PHF1蛋白水平。结果 α7 nAChR基因沉默组与空质粒组相比，α7 nAChR mRNA和蛋白质表达水平分别降低了94%(P<0.01)和82%(P<0.01)；Tau蛋白水平升高了65% (P<0.01)；PHF1蛋白水平升高了58% (P<0.05)。结论 α7 nAChR基因表达抑制后Tau和PHF1蛋白水平明显升高，Tau蛋白和PHF1蛋白表达增加直接促进神经元纤维缠结的形成，这可能与AD的病理进程有一定关系。

阿尔茨海默病；Tau；配对螺旋样纤维蛋白1；α7神经型尼古丁受体

阿尔茨海默病(AD)是一种神经元退行性变疾病，临床上主要表现为进行性认知功能障碍和记忆力减退等〔1〕。病理学以细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)过度沉积形成的老年斑(SPs)以及神经细胞内tau蛋白过度磷酸化引起的神经元纤维缠结(NFTs)为主要特征〔2〕。高度磷酸化后的tau蛋白与微管分离，加速微管解聚，可自身聚集促进配对螺旋样纤维(PHF)的形成〔3〕。PHF是NFT的主要成分，也是AD病理变化的基本元素〔4〕，PHF表达水平与Tau蛋白及Tau蛋白磷酸化程度密切相关，Tau蛋白过度磷酸化使游离Tau增多，游离Tau蛋白是形成PHF的前提基础，二者共同加速NFT的形成。在AD患者大脑的海马、皮质区，尼古丁受体数目减少，α7 亚单位蛋白表达明显降低，α7神经型尼古丁受体(nAChR)与神经细胞毒性作用紧密相连〔5〕，在AD相关病变研究中发挥重要作用。本实验用体外合成的α7 nAChR shRNA Plasmid(h)转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，研究受体抑制后Tau蛋白和PHF1蛋白表达情况，探究α7 nAChR与Tau和PHF1蛋白之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 源于人脑的SH-SY5Y神经细胞由本课题组保存；稳定转染α7 nAChR shRNA 表达质粒和空质粒的SH-SY5Y细胞由本课题组液氮保存；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶购于Hyclone公司；嘌呤霉素购于Sigma公司；Trizol试剂购于Invitrogen公司；α7 nAChR、β-actin引物由上海生物工程有限公司设计并合成；RNA逆转录试剂盒购于Thermo公司；兔抗人Tau单克隆抗体(ab32057)、兔抗人PHF1单克隆抗体(ab184951)均购于英国Abcam公司；鼠抗人β-actin 单克隆抗体(M20010)购于美国Abmart公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(7074s)购于美国Cell Signaling公司；HRP标记的羊抗鼠二抗(ZB2305)购于中杉金桥公司，蛋白marker购于美国Thermo公司；5×蛋白上样缓冲液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制剂、显影液、定影液均购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白磷酸酶抑制剂混合物、RIPA高效裂解液均购自北京索莱宝科技有限公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增强化学发光法(ECL)-Plus发光试剂购自美国Millipoe公司；胶片购于中国柯达公司。

1.2 细胞培养 空白组SH-SY5Y细胞以DMEM为培养基，其中添加10%胎牛血清、1%双抗 (青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml)，转染α7 nAChR shRNA Plasmid (h)实验组和转染Control shRNA Plasmid-B空载体组SH-SY5Y细胞以添加13%胎牛血清、0.004 g/L嘌呤霉素的DMEM为培养基，置于含5% CO2的37℃恒温箱中进行培养。

1.3 实时荧光定量PCR检测α7 nAChR mRNA表达水平 采用Trizol一步法提取细胞总RNA，用RNA逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA，并以此为模板进行实时荧光定量PCR。α7 nAChR和内参β-actin引物序列见表1，用ABI StepOnePlus型实时荧光定量PCR仪采集α7 nAChR及内参β-actin扩增各循环荧光信号，用SDS2.1软件收集荧光信息并分析相关资料，主要分析α7 nAChR ΔΔCt值及RQ值，RQ=2-ΔΔCt。计算沉默组与空载体对照组之间的相对水平。

1.4 Western印迹检测α7 nAChR、Tau及PHF 1蛋白表达水平 按RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制剂混合物=100∶1∶1配制裂解液，收集细胞，用冷冻离心机12 000 r/min、4℃、15 min离心，吸取蛋白质上清液。采用二甲基哇啉(BCA)定量法测定蛋白浓度；运用Western印迹法检测α7 nAChR、Tau和PHF1蛋白表达水平及其各自内参β-actin的蛋白表达情况。运用Image J 软件进行图片像素灰度值处理，以β-actin条带作为内对照，计算α7 nAChR、Tau、PHF1蛋白条带相对其内参的灰度比值并作为目的蛋白的相对表达水平。每组蛋白复孔二个，进行三次独立重复实验。

1.5 统计学方法 应用SPSS22.0软件行独立样本t检验。

表1 荧光定量PCR引物序列及产物片段

基因引物序列扩增片段长度(bp)α7nAChR5′accactcaccgtctacttctcc3′1675′tgatgtcgccgatgatgc3′β⁃actin5′tggcaccacaccttctacaatg3′1035′tcatcttctcgcggttggc3′

2 结 果

2.1 稳定转染α7 nAChR shRNA Plasmid(h)后细胞α7nAChR mRNA及其蛋白质表达水平 受体沉默组与空质粒组相比，α7nAChR mRNA〔(0.06±0.02)vs(1.05±0.06)〕和蛋白质水平〔(18±6) vs (104±5)〕分别降低了94%(P<0.01)和82%(P<0.01)。说明稳定转染α7 nAChR shRNA 表达质粒的SH-SY5Y细胞，α7 nAChR 在mRNA和蛋白质水平表达受到明显抑制。

2.2 α7 nAChR基因沉默对Tau和PHF1蛋白表达水平的影响 受体沉默组与空质粒组相比，Tau蛋白〔(171±8)vs(104±14)〕和PHF1蛋白质〔(162±7)vs(102±9)〕水平分别升高了65%(P<0.01)和58%(P<0.05)。见图1。

图1 α7 nAChR基因沉默细胞Tau和PHF1蛋白表达水平

3 讨 论

在AD的发展过程中，nAChR 扮演重要角色，通过对AD患者进行尸检发现大脑皮层萎缩、nAChRs密度降低、数量减少〔6〕。给予α7nAChR特异性激动剂处理后，能减弱Aβ诱导的神经细胞凋亡，从而发挥一定的神经保护作用〔7〕。体外实验证实在海马神经元和大脑皮层神经元尼古丁能降低Aβ 聚集及其引起的神经毒性〔8〕；同时，用α7 nAChRs激动剂处理细胞，Tau蛋白磷酸化水平增高，而预先用α7 nAChRs阻滞剂处理后，Aβ诱导Tau蛋白磷酸化水平减弱〔9〕。采用RNA 干扰技术，沉默SH-SY5Y 细胞α7 nAChR，Aβ毒性作用可以明显增强〔10〕，尼古丁受体对Aβ造成的毒性损伤具有一定的神经保护作用。另外，也有研究认为AD患者中α7 nAChR明显减少，是由于其与Aβ相互作用所致并诱导神经元凋亡，因此猜测α7 nAChR激动剂可能会成为治疗AD很好的药物〔11〕。

近年来研究较多的AD主要病变特点之一NFT由Tau蛋白诱导形成，Tau蛋白是一种神经元微管相关细胞骨架蛋白，主要在神经元内表达，生物学功能以催化微管装配和稳定微管结构为主。在AD患者脑内Tau蛋白主要存在三种形式，即细胞质正常Tau蛋白(C-Tau)，过度磷酸化易溶型Tau蛋白(ADP-Tau)和聚集成配对PHF的Tau蛋白(PHF-Tau)；在PHF-Tau中已发现45个磷酸化位点，主要是丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)残基的磷酸化。Tau高度磷酸化后稳定性降低，不仅可以加速微管解体，自身聚集成PHF〔3〕，还能加快游离Tau蛋白在大脑和脑脊液中沉积形成细胞内NFT〔12〕。NFT通过损伤神经元、神经胶质细胞和tau蛋白功能等多种途径导致强大的神经毒性。

Tau蛋白作为AD一种主要研究蛋白，在其他疾病中也逐渐被发现，目前已经证实有超过20种神经系统退行性疾病与Tau蛋白有关〔13〕。在与Tau相关的疾病中，几乎都主要表现为Tau蛋白的磷酸化异常从而大量聚集形成NFT〔14〕。病理学相关研究发现AD患者出现痴呆的严重程度与其脑组织中的NFTs数量呈正相关〔15〕。在病理状态下，Tau蛋白往往被异常磷酸化，高度磷酸化的Tau蛋白失去与微管的结合能力，微管结构不稳定，导致神经元骨架瓦解，引起AD发病，同时细胞内游离Tau蛋白增多，游离的异常磷酸化Tau蛋白彼此连接形成PHF，成对螺旋丝再相互缠绕成混合微丝，最后高度聚集形成NFT。也就是说，异常过度磷酸化Tau蛋白是PHF亚单位，PHF又作为NFT的主要组成成分逐步促成AD的病理发展。螺旋丝种类繁多，PHF1即为PHF中较为常见的一种，虽然目前PHF在AD的相关研究中提及不多，但其作为NFT形成的关键及主要元素，其对AD的发病研究有着更深刻的意义。实验结果显示，α7 nAChR基因表达沉默时，Tau蛋白和PHF1蛋白水平都明显升高，说明α7 nAChR可以调节Tau和PHF蛋白的表达，从而影响NFT的形成过程，在AD的发病中起着重要作用。

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5 Conejero-Goldberg C，Davies P，Ulloa L.Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor：a link between inflammation and neurodegeneration〔J〕.Neurosci Biobehav Rev，2008;32(4)：693-706.

6 Lilja AM.Functional interactions of fibrillar and oligomeric amyloid-with alpha7 nicotinic receptors in Alzheimer′s disease〔J〕.Alzheimers Dis，2011;23(2)：335-47.

7 Gu RX，Gu H，Xie ZY，etal.Possible drug candidates for Alzheimer′s disease deduced from studying their binding interactions with alpha7 nicotinic acetylcholine receptor〔J〕.Med Chem，2009;5(3)：250-62.

8 Zhang J，Liu Q，Chen Q，etal.Nicotine attenuates beta-amyloid-induced neurotoxicity by regulating metal homeostasis〔J〕.FASEB J，2006;20(8)：1212-4.

9 Hu M，Waring JF，Gopalakrishnan M,etal.Role of GSK-3β activation and α7 nAChRs in Aβ1～42-induced Tau phosphorylation in PC12 cells〔J〕.J Neurochem，2008;106(3)：1371-7.

10 Qi XL，Kai OY，Ren JM，etal.Preventing expression of the nicotinic receptor subunit α7 in SH-SY5Y cells with interferen cRNA indicates that this receptor may protect against the neurotoxicity of Aβ〔J〕.Neurochem Res，2013;38(5)：943-50.

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〔2016-05-14修回〕

(编辑 袁左鸣)

Influence of inhibited α7 nicotinic acetylcholine receptor gene expression on level of Tau and PHF1 protein in SH-SY5Y cells

ZHOU Fei,ZHANG Shu-Li,LI Yi,et al.

The Key Laboratory of Molecular Biology Laborary, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China

Objective To investigate the influence of inhibited gene expression of α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on the level of Tau and PHF1 proteins in SH-SY5Y cells and study the role of α7 nAChR in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD).Methods The level of α7nAChR mRNA and protein were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. The protein level of Tau and PHF1 were determined by Western blot.Results Compared with negative controls, the expression of α7nAChR at mRNA and protein levels in the SH-SY5Y cells with α7 nAChR silencing were decreased by 94% and 82%, respectively. And the expression of Tau and PHF1 proteins were increased by 65% and 58%, respectively.Conclusions The inhibited gene expression of α7 nAChR by RNA interference may markedly stimulate the expression of Tau and PHF1 proteins, which directly might develop the formation of NFT, so the variation of Tau and PHF1 proteins induced by α7 nAChR gene silencing may be related to the pathogenesis of AD.

Alzheimer's disease;Tau;PHF1;α7 nAChR

国家自然科学基金资助项目(81360178)；教育部“长江学者和创新团队发展计划资助”(IRT13058)；贵州省科技厅重大专项(黔科合重大专项字2014〔6008〕)；贵州省科技厅项目(201344，黔科合J字〔2012〕2055)

齐晓岚(1976-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事老年性痴呆发病机制研究。

周 飞(1990-)，女，硕士，主要从事神经分子生物学研究。

R749.01

A

1005-9202(2016)24-6049-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.001

1 贵州医科大学第一附属医院神经外科