5-HT与慢传输型便秘相关性的研究

赵兵 孔鹏飞 吴至久 唐学贵

•论著•

5-HT与慢传输型便秘相关性的研究

赵兵 孔鹏飞 吴至久 唐学贵

目的通过建立大鼠慢传输型便秘模型，检测便秘大鼠结肠5-HT的表达情况，探讨5-HT与慢传输型便秘是否存在相关性。方法SD大鼠48只随机分为4组：空白组，模型组，莫沙必利治疗组，麻仁丸治疗组。空白组大鼠用生理盐水灌胃，便秘模型组和治疗组大鼠用复方地芬诺酯灌胃，建立大鼠慢传输型便秘（STC）模型。模型建立后，治疗组大鼠分别用莫沙必利、麻仁丸灌胃，观察各组大鼠大便粒数及大便湿重。治疗结束后将大鼠集体处死，取大鼠近端结肠标本，用免疫组织化学的方法检测各组大鼠结肠5-HT的表达情况。使用彩色病理图像分析系统对阳性表达的平均光密度值（MD）进行半定量分析。4组数据之间的比较采用方差分析。结果免疫组化结果显示：便秘组结肠5-HT的MD值（0.453±0.028）大于空白对照组（0.148±0.011）、莫沙必利治疗组（0.316±0.012）及麻仁丸治疗组（0.291±0.010），t值分别为34.209、15.307、18.296，P均＜0.001，差异有统计学意义；莫沙必利治疗组（0.316±0.012）和麻仁丸治疗组（0.291±0.010）的MD值均大于空白对照组（0.148±0.011），t值分别为35.983、31.919，P均＜0.001，差异有统计学意义。结论便秘大鼠结肠5-HT的表达增高，可能影响肠神经传导功能，从而导致便秘的发病。

5-HT；慢传输型便秘；实验研究

便秘是由多种原因导致的大肠功能失常所致，以排便间隔时间延长，大便干结难解或虽有便意而排出困难为临床表现的病症。同时，便秘也是某些急慢性疾病中的一个症状，长时间便秘不及时治疗，往往会给病人带来痛苦和精神压力，甚至引起严重后果，尤其是心脑血管意外［1］。慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是临床上的常见病及多发病，其发病机制复杂。目前对其病因研究主要是集中在以下几个方面：药物的滥用、不良的生活习惯、内分泌疾病、心理因素等，而其发病机制的研究则主要集中在肠道动力、肠神经系统、胃肠神经肽、Cajal间质细胞这几个方面［2］。其中，对肠神经递质的研究是近年来研究慢传输型便秘病因的热点方向之一。5-HT作为重要的肠神经递质，参与了肠道的动力及感觉调节过程。为求进一步探索5-HT与慢传输型便秘发病之间的关系，我们设计动物实验，建立SD大鼠慢传输型便秘模型，探究5-HT在STC发病过程中的作用机制。

资料和方法

一、实验材料

（一）实验动物

SD大鼠48只，雌雄各半，体重（200±20）g，清洁级，由川北医学院动物实验中心提供。

（二）实验药物及试剂

复方地芬诺酯（国药准字：H41023169，河南鼎昌药业有限公司提供）。莫沙必利（国药准字：H20031110，成都康弘药业集团股份有限公司提供）。麻仁丸（国药准字：Z50020517，太极集团重庆桐君阁药厂有限公司提供）。大鼠5-HT一抗免疫组化试剂，北京博奥森生物技术有限公司。兔SP检测试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司。

（三）主要仪器

主要仪器有微波炉，切片机，-80 ℃、-20 ℃、-4 ℃低温冰箱，电子天平，Olypmus光学显微镜，微量移液器，电热恒温水浴锅。

二、实验方法

（一）动物分组

48只SD大鼠，随机分为4组：空白组、便秘模型组、莫沙比利治疗组、麻仁丸治疗组。

（二）动物造模

根据万锦州等［3］复方地芬诺酯造模方法稍作改进，空白组大鼠每日给予生理盐水0.2 mL/10 g，便秘模型组和治疗组大鼠每日给予复方地芬诺酯10 mg/kg加入生理盐水配制成混悬液灌胃，正常进水进食，连续7 d作为1个疗程，连用3疗程，疗程间停药1 d。第三疗程末次给药后记录各组大鼠24 h内大便粒数和大便湿重，确定慢传输型便秘模型的建立。

（三）药物治疗方法

空白组，不造模，不治疗；模型组，只造模，不治疗。便秘模型建立成功后：莫沙必利组，按2.5 mg/kg用药量，加入生理盐水配制成混悬液4 mL，通过灌胃给药，连续3 d作为1个疗程，共给药2个疗程，疗程间停药1 d，整个过程正常喂食进水。麻仁丸组，按3.0 g/kg 用药量，加入生理盐水配制成混悬液4 mL，通过灌胃给药，连续3 d作为1个疗程，共给药2个疗程，疗程间停药1 d，整个过程正常喂食进水。

（四）标本采集

动物模型建好后，用颈椎脱臼法集体处死所有大鼠，剖腹取近端结肠6 mm～8 mm，在生理盐水中清洗干净，放入4%多聚甲醛中固定，室温保存。

（五）免疫组化检测

取组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4 μm切片；将组织切片放在60 ℃恒温电烤箱中1 h后取出；切片经脱蜡水化，抗原修复：滴加3% H2O2，在37 ℃下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性；滴加山羊血清封闭液，在37 ℃下孵育15 min；滴加一抗（1：100），4 ℃冰箱内孵育过夜；滴加二抗（生物素标记的山羊抗兔IgG），37 ℃孵育30 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育15 min；DAB显色，在显微镜下掌握染色程度，自来水充分冲洗。苏木素复染，盐酸乙醇分化；常规脱水、透明、封片及镜检。

所有切片都设阴性对照（不滴加一抗，PBS代替一抗），染色阳性结果为：5-HT阳性产物呈棕褐色或棕红色。每张切片均随机选取5个具有代表性的高倍镜视野（×400），用高分辨率图像分析仪Image-Proplus 6.0提供的工具来测定各视野的平均光密度（density mean，MD）值，MD值越大说明阳性细胞越多。

三、统计学分析

用SPSS19.0 软件对各组数据进行统计，计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，采用ANOVA方法分析，多组均数差别的多重比较应用SLD和SNK方法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

各组大鼠近端结肠5-HT免疫组化结果示：主要表达于大鼠结肠肌间神经丛的神经元细胞胞浆，粘膜层及粘膜下肌层也有表达，呈棕红色。空白组大鼠神经元细胞阳性表达分布均匀；模型组与空白组相比，阳性表达较空白组增高。莫沙必利治疗组、麻仁丸治疗组与模型组相比，阳性表达降低，但与空白组相比，阳性表达升高（图1～4）。

各组大鼠近端结肠5-HT表达平均光密度值（MD）统计显示：空白组分别和便秘组（t值=34.209，P＜0.001）、莫沙必利组（t值=35.983，P＜0.001）、麻仁丸组（t值=31.919，P＜0.001）相比，其MD值低于其他各组，差异有统计学意义；便秘模型组分别和莫沙必利组（t值=15.307，P＜0.001）、麻仁丸组（t值=18.296，P＜0.001）相比，其MD值高于其他2组，差异有统计学意义；莫沙必利组和麻仁丸组的MD值比较（t值=5.488，P＜0.001），其MD值高于麻仁丸组，差异有统计学意义（表1）。

图1 大鼠近端结肠5-HT免疫组化结果。5-HT蛋白主要表达于大鼠结肠肌间神经丛的神经无细胞胞浆，粘膜层及粘膜下肌层也有表达，呈棕红色。图1A 空白组结肠5-HT的表达（×400）；图1B 便秘组结肠5-HT的表达（×400）；图1C 莫沙必利组结肠5-HT的表达（×400）；图1D 麻仁丸组5-HT的表达（×400）

讨 论

随着人们对慢传输型便秘研究的不断深入，肠神经递质在便秘发病机制中的作用越来越引起人们的重视。近年来，有关5-HT和便秘发病的研究逐渐增多。5-HT为一种吲哚类衍生物，又名血清素，能增强血管和平滑肌收缩。5-HT能神经元广泛的分布于胃肠道各层组织中，能调节胃肠运动、感觉及分泌。5-HT与胃肠道受体（5-HT3、5-HT4受体）结合起作用，而通过5-HT转运蛋白在突触间隙的再摄取灭活。因此，5-HT的合成和释放过程，以及受体状态等异常都可能导致系列的临床症状改变。

作为肠神经系统中的一种重要神经递质，5-HT在引发胃肠蠕动及调节内脏感觉中起关键作用［4］。前期已经有部分学者研究发现，5-HT与便秘的发病存在一定的相关性。如：雷怀成等［5］研究发现运动迟缓型便秘肠神经系统5-HT免疫反应的异常变化，可能是结肠迟缓性便秘的神经病理基础。童卫东等［6］通过免疫组化检测慢传输型便秘患者乙状结肠肌间丛一氧化氮和5-HT的变化，结果表明一氧化氮及5-HT免疫反应性增强是患者结肠传输减慢的神经病理基础。Crowell MD等［7］认为肠嗜铬细胞和5-HT的信号改变可能导致胃肠动力障碍，内脏高过敏性以及肠道分泌的异常，5-HT参与腹泻和便秘型肠易激综合症，慢传输型便秘的病理生理过程。陆敏等［8］通过对便秘患者结肠粘膜5-HT检测发现，便秘患者5-HT表达明显高于对照组。Sjölund等［9］用免疫组化的方法检测慢传输型便秘患者结肠粘膜神经递质的变化时发现，便秘组患者升结肠的5-HT阳性细胞较对照组明显增多。Shin等［10］研究发现高选择性5-HT4受体激动剂对慢性便秘的治疗具有很高的安全性和可靠性。有学者通过临床试验发现5-HT4受体激动剂对功能性便秘的肠道传输功能具有明显的改善作用［11］。Lee等［12］研究发现一种新型的5-HT4受体激动剂可以增强小鼠结肠运动功能。JM Hoffman等［13］研究认为激活结肠粘膜5-HT4受体能够增强肠道的传输功能。

表1 组大鼠结肠免疫组化5-HT表达平均光密度值（MD）比较（±s）

表1 组大鼠结肠免疫组化5-HT表达平均光密度值（MD）比较（±s）

注：*与空白组比较t值分别为34.209、35.983、31.919，P值均小于0.001；#与便秘模型组比较t值分别为15.307、18.296，P值均小于0.001；#组间比较t值=5.488，P＜0.001

分组 例数 5-HT平均光密度值空白对照组 12 0.148±0.011便秘模型组 12 0.453±0.028*莫沙比利治疗组 12 0.316±0.012*#麻仁丸治疗组 12 0.291±0.010*#

本实验研究发现，5-HT主要表达于大鼠结肠肌间神经丛的神经元细胞胞浆，粘膜层及粘膜下肌层也有表达。便秘模型组与空白组相比，阳性表达较空白组增高。经莫沙必利、麻仁丸治疗后，两治疗组与模型组相比，阳性表达降低。由此，我们推断5-HT作为重要的肠神经递质，通过在结肠的高表达，影响肠神经传导，从而形成结肠传输障碍，可能是导致便秘的作用机制之一。实验研究的发现，为我们探索便秘的发病机制及临床药物治疗靶点提供了新的方向。

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Experimental study on the relationship between 5-HT and slow transit constipation

Zhao Bing,Kong Pengfei,Wu Zhijiu,Tang Xuegui.Anorectal Department,The Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China

Tang Xuegui,Email:txg668nc@sohu.com

ObjectiveTo detect the expression of 5-HT in the colon of rats with constipation by establishing the model of slow transit constipation(STC),and to explore the correlation between 5-HT and STC.MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into 4 groups:blank group,model group,mosapride group,maren pill group.The rats of blank group were given normal saline by gastric irrigation,while the rats of model group and treatment groups were given diphenoxylate by intragastric administration before treated.When established the model of STC,the rats of treatment groups were respectively given mosapride,maren pills,and the stool grain and stool wet weight were observed.The proximal colons were collected.Expression of 5-HT in the proximal colon by immunohistochemistry were detected.The staining results were analyzed semi-quantitively by computerized color image analyzer as the following parameter:mean density.Data were analyzed by ANOVA.ResultsThe density means(MD)of 5-HT in the colon of model group(0.453±0.028)was greater than the control group(0.148±0.011)(t=34.209,P＜0.001),mosapride group(0.316±0.012)(t=15.307,P＜0.001),maren pill group(0.291±0.010)(t=18.296,P＜0.001),and the difference was statistically signifcant;The density means(MD)of mosapride group(0.316±0.012)(t=35.983,P＜0.001)and maren pill group(0.291±0.010)(t=31.919,P＜0.001)were higher than control group,which the difference was statistically significant.ConclusionThe increased expression of 5-HT in the colon of rats with constipation may affect on the intestinal nerve conduction function,which led to the incidence of constipation.

5-HT;Slow transit constipation;Experimental study

2016-10-17）

（本文编辑：杨明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.06.009

四川省杰出青年学术技术带头人后续资助计划（No.2011JQ0052）

637000 南充，川北医学院附属医院肛肠科

唐学贵，Email：txg668nc@sohu.com

赵兵,孔鹏飞,吴至久,等.5-HT与慢传输型便秘相关性的研究[J/CD].中华结直肠疾病电子杂志,2016,5(6):499-502.