利用GEO数据库分析结肠癌中EZH2及其相关基因的表达与意义

宋达为黄睿汤庆超马天翼罗玥琛王贵玉王锡山

•论著•

利用GEO数据库分析结肠癌中EZH2及其相关基因的表达与意义

宋达为1，2黄睿1，2汤庆超1，2马天翼1，2罗玥琛1王贵玉1，2王锡山3

目的探讨果蝇Zeste基因增强子人类同源物（EZH2）在结肠癌的表达情况、评估对结直肠癌患者预后的意义，并分析预测与其相关的基因及细胞通路。方法通过GEO数据库下载基因芯片GSE17538数据内包含232例结直肠癌病例；结合R2平台，筛选出与EZH2表达显著相关的基因并进行GO和KEGG通路分析；通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线，研究EZH2与患者预后、生存之间的关系。结果232例结肠癌标本中，EZH2的表达与年龄（χ2=4.426，P=0.035）、AJCC分期（χ2=8.259，P=0.041）和分化程度（χ2=7.301，P=0.026）有关，与性别（χ2=0.622，P=0.430）无关。全部检测出与EZH2表达显著相关基因共4 305个（其中正相关2 240个、负相关2 065个），对GO及KEGG通路分析后发现其中1 509个相关基因涉及细胞周期、RNA的转录、DNA复制等多个肿瘤发生、发展过程。Kaplan-Meier法分析，EZH2的表达与患者的无病生存期有相关性（P＜0.05）。结论推测EZH2可成为研究患者预后的分子标志物，为未来深入研究提供参考。

结直肠肿瘤；基因表达；EZH2；细胞周期；基因芯片

结直肠肿瘤是目前第3常见的恶性肿瘤。根据中国癌症统计分析数据，2015年结直肠癌的发病率和死亡率均位于第5位，并且发病率和死亡率均呈逐年上升趋势［1］。结直肠癌的发生与发展是一个多步骤、多因素的过程。随着近20年来，以核酸测序为代表的高通量组学分析技术的日趋成熟，结直肠癌的分子机制研究取得了巨大的进步，其中与表观遗传学相关的EZH2基因成为了研究的热点基因之一。

EZH2为多梳蛋白抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的催化活性亚基，位于7号染色体的q35区，由20个外显子及19个内显子构成［2］。EZH2是多枢基因（PcG）蛋白的重要组成部分，PcG蛋白在胚胎发育、肿瘤的发生发展和干细胞自我更新等方面有着重要的作用。PcG蛋白由两个核心蛋白复合体PRC1和PRC2组成。PRC2属于组蛋白甲基转移酶，最早是在人类细胞和果蝇胚胎中纯化和命名的。而人类和果蝇PRC2中存在一个十分相似的中央亚基成分，是一个保守的催化亚基，在人类中称其为EZH2［3］。EZH2可以联合多个因子共同协作，在包括乳腺癌［4］、前列腺癌［5］、胃癌［6］等癌症形成中起到重要的作用。

本次研究通过提取NCBI中GEO数据库中的数据，利用统计学方法及R2分析平台分析GEO数据库中结肠癌基因芯片数据，对基本临床信息、生存信息、相关基因及相关信号通路进行分析。从而为EZH2因子在结直肠癌的进一步研究机制提供线索和思路。

资料与方法

一、一般材料

从NCBI的GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下载基因表达谱公共数据集GSE17538［7］，此数据集为包含EZH2表达数据的人类结肠肿瘤表达谱，包括232例结肠癌样本。

二、方法

通过提取整理芯片内的临床信息，分析EZH2基因与年龄、性别、肿瘤分期、组织分化程度、生存数据之间的关系。基因相关性分析利用R2芯片分析平台（http://r2.amc.nl）进行运算，并通过GO及 KEGG通路分析工具对与EZH2相关的基因和通路进行分析。统计学软件为SPSS 20.0，对于组间比较采用χ2检验及独立样本t检验；生存数据处理采用Kaplan-Meier法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、EZH2在数据集中的基本表达

数据集样本232例患者中全部包含EZH2表达信息，按照中位数，将全部样本分为高表达组（n=115）及低表达组（n=117）。数据集的232位患者基本信息如下（表1），经过统计学分析发现EZH2的表达与年龄（χ2=4.426，P=0.035）、AJCC分期（χ2=8.259，P=0.041）和分化程度（χ2=7.301，P=0.026）有关，与性别（χ2=0.622，P=0.430）无关。

表1 EZH2基因与临床信息的相关性分析（例）

二、EZH2与患者预后的关系

利用R2数据平台，通过Kaplan-Meier法进行生存分析。结果显示（图1），在数据集中EZH2的表达水平与患者无病生存期显著相关（P=0.019），高表达患者的无病生存期要显著长于低表达患者。与患者的总生存时间没有明显差异。

图1 EZH2表达水平与患者预后之间的关系

三、EZH2相关基因分析

利用R2平台分析，对232个样本中的基因芯片结果进行统计学分析，全部检测出与EZH2表达显著相关基因共4 305个（其中正相关2 240个、负相关2 065个），前10正负相关基因展示如下（表2）。

表2 与EZH2表达成正负相关的基因

四、基因通路分析

通过KEGG分析，发现与EZH2相关的4 305基因中，共有1 650个基因涉及17个信号通路（P＜0.01），主要包括细胞周期、RNA的转录、DNA复制、剪接体形成、蛋白酶体形成等分子机制，由于涉及基因较多仅列出部分基因（表3）；通过GO分析，EZH2和其相关基因与细胞周期、RNA结合、胚胎发育等分子机制有密切的相关性（表4）。

讨 论

结直肠癌是目前最常见的消化道肿瘤之一。根据美国癌症协会（American Cancer Society，ACS）最新发布的数据，2016年美国的结直肠癌的预计新发例数为134 490例，其中男性为70 820例，占男性全部预计新发癌症例数的8%，女性为63 670例，占女性全部预计新发例数的8%。结直肠癌相关的预计死亡例数为49 190例，位于所有癌症死亡例数的第三位［8］。随着结直肠癌发生、发展机制的研究的深入，结直肠癌治疗特异性靶点的研究逐渐成为热点，其中EZH2基因在近年来引起了研究者的关注。

EZH2首次发现是1996年，Hobert等［9］发现了与果蝇Zeste基因增强子相似的蛋白。2003年Hillier等［10］在研究中证实人EZH2基因的位置。作为多枢基因核心家族的成员，EZH2可编码组蛋白甲基转移酶，通过两种方式介导靶基因的沉默：（1）通过催化H3K27（组蛋白H3赖氨酸27）三甲基化；（2）通过联合DNA甲基转移酶，使靶基因CpG岛区DNA甲基化。研究发现，EZH2在多种肿瘤发展的生物学行为中起着重要的作用［11-12］。但是在结直肠肿瘤的研究中，EZH2基因的作用机制并不明确，通过生物信息学的研究，我们可以对EZH2相关的作用机制及信号通路，为今后的研究起借鉴作用。

从本次实验的232样本中可以看出，EZH2的表达与年龄、AJCC分期和分化程度有关，与性别无关。根据Kaplan-Meier生存曲线分析，EZH2对于患者的无病生存期有预测作用，高表达患者的无病生存期要显著长于低表达患者。芯片内有32例患者的无病生存信息缺失，可能对结果有一些影响。但从结果可以看出，EZH2在结直肠癌中是一个保护性因素。但结果与一些实验的结果有冲突，因为传统观点认为，EZH2在结直肠癌中呈高表达，属致癌基因［13］。在细胞表型试验中，通过抑制EZH2表达可以抑制细胞的迁移及侵袭，抑制细胞的生长［14］。实验结果的原因可能有两点：（1）由于本芯片数据集主要是mRNA水平的检测，与实际的蛋白表达是有差别的；（2）EZH2基因在结直肠癌进展的不同阶段所起的作用并不相同。

通过R2平台分析，在本数据集中共包含54 676个基因，检测出与EZH2表达显著相关基因共4 305个（其中正相关2 240个、负相关2 065个），占所有基因数的7.8%，这也证明了EZH2在本组数据库样本人群中，起到了重要关联作用。本文仅分别列出与EZH2正负相关的10个基因，为进一步研究起到指导作用。之后对这4 305个基因进行KEGG分析和GO分析，可以看出，EZH2参与多个生物学行为过程，包括RNA的转录、DNA复制、剪接体形成、蛋白酶体形成、胚胎形成等。从两种分析方法结果来看，EZH2及其相关基因与细胞周期表现出了密切的相关性，而其中主要涉及的基因包括CDK家族、ANAPC家族、CDC家族等。2011年Zeng等［15］在研究中发现CDK1及CDK2可以促进EZH2的磷酸化来影响细胞的分化。2016年，Sun等［16］人的研究显示，在卵巢癌中抑制EZH2的功能会抑制CDK1及CDK2的表达。但是目前在结直肠领域，EZH2与CDK家族之间的相关研究较少，这为今后研究EZH2相关机制提供了思路。

表3 与EZH2相关基因的KEGG分析

表4 与EZH2相关基因的GO分析

通过公开平台基因芯片数据分析方法进行实验较传统实验方法有数据量大、花费小的特点，但数据信息多为mRNA水平的检测，所以还需要进行蛋白水平的验证。但是通过基因芯片的数据分析，可以对课题可行性进行初步的探索，预测结果并提供理论证据。本实验中EZH2的表达与患者的无病生存期有明显相关性，为下一步免疫组化验证提供了参考。综上所述，EZH2可以作为研究患者预后的分子标志物，为未来的研究提供了新的方向。

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Identification of EZH2-related key pathways and genes in colorectal cancer using bioinformatics analysis.

Song Dawei1,2,Huang Rui1,2,Tang Qingchao1,2,Ma Tianyi1,2,Luo Yuchen1,Wang Guiyu1,2,Wang Xishan3.1The Department of Colorectal Cancer,The Second Affliated Hospital,Harbin Medical University,Harbin 150086,China;2Colorectal cancer research institution,Harbin Medical University,Harbin 150086,China;3Department of Colorectal Surgery,National Cancer Center/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100021,China

Wang Xishan,Email:wxshan1208@126.com;WangGuiyu,Email:guiywang@163.com

ObjectiveThe aim of this study was to investigate the prognosis value of the EZH2 expression and signatures during CRC and uncover their potential mechanisms in colorectal cancer.MethodsThe gene expression profles of GSE17538 were downloaded from GEO database.The GSE17 538 data-set contained 232 samples.The data was combined by the R2 platform to search the genes which are associated with a significant expression with EZH2.The gene ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway(KEGG)enrichment analyses were performed by R2 platform.The surival curves were estimated using the Kaplan-Meier method.ResultsIn 232 cases,the expression of EZH2 in colorectal carcinoma was associated with age(χ2=4.426,P=0.035),AJCC stage(χ2=8.259,P=0.041)and differentiation(χ2=7.301,P=0.026),except for sex(χ2=0.622,P=0.430);In total,4305 genes were identifed which are associated with a signifcant expression with EZH2,including 2240 up-regulated genes and 2065 down-regulated genes.GO analysis and KEGG pathway analysis results showed that these were signifcantly enriched in biological processes ,including proliferation in cell cycle,RNA transcription and DNA replication；Using the Kaplan-Meier method we found the expression of EZH2 is related with diseasefree survival.ConclusionEZH2 could be used as a potential prognostic marker and a therapeutic target in colorectal cancer.

Colorectal neoplasms;Gene expression;EZH2;Cell cycle;Gene microarray

2016-11-20）

（本文编辑：刘正）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.06.004

黑龙江省医学科学院科研计划项目（No.201504）；哈尔滨医科大学科研基金（No.KYB2015-30）

150086 哈尔滨医科大学附属第二医院结直肠肿瘤外科1；150086 哈尔滨医科大学大肠癌研究所2；100021 北京，国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院结直肠外科3

王锡山，Email：wxshan1208@126.com；王贵玉，Email：guiywang@163.com

宋达为,黄睿,汤庆超,等.利用GEO数据库分析结肠癌中EZH2及其相关基因的表达与意义[J/CD].中华结直肠疾病电子杂志,2016,5(6):475-479.