含二硫键的硼酸酯交联纳米粒子的制备研究

王彦霞， 万宗华， 柴志华

(华北科技学院，北京 东燕郊 101601)



含二硫键的硼酸酯交联纳米粒子的制备研究

王彦霞， 万宗华， 柴志华

(华北科技学院，北京 东燕郊 101601)

本文首先制备含硼酸的单体3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(MAPBA)，并采用可逆加成-断裂链转移活性自由基聚合(RAFT)制备含硼酸的均聚物聚(3-丙烯酰胺基苯硼酸)(PMAPBA)。接着通过壳聚糖(CS)与N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)反应制备巯基功能化的壳聚糖(CS-NAC)。最后，将PMAPBA与CS-NAC在氧气环境下组装制备含二硫键的硼酸酯交联纳米粒子，发现纳米粒子呈球形，随CS-NAC浓度的增加，其粒径及zeta电位增加，且所有的纳米粒子具有比较均一的尺寸。

硼酸；可逆加成-断裂链转移活性自由基聚合；二硫键；纳米粒子

0 引言

许多研究者通过独特的分子间相互作用(如：氢键相互作用、酸碱相互作用、正负离子相互作用等)来制备自组装材料，这是因为该类材料在药物传递、生物材料、膜分离技术等诸多方面有重要的用途[1-3]。近年来，硼酸及其衍生物与含二醇的化合物之间的相互作用成为研究的热点[4]，硼酸及其衍生物可以快速可逆地与二醇基团形成低能量的环状硼酯键，因此该反应可以精确控制产物的结构[5]。

含糖化合物含有丰富的羟基，因此其可以和硼酸反应。与人工合成的含糖化合物相比，天然多糖往往更受药剂学研究者的青睐，这是因为天然多糖大多毒性低、低成本、易得到、可生物降解。在诸多天然多糖中，一种由甲壳素去乙酰化得到的弱碱性的多糖-壳聚糖具有很多有用的生物学特性(生物相容性、生物可降解性、生物活性等)[6,7]。许多传统使用的壳聚糖分子量一般比较大，因此大都仅能溶解在pH = 4的酸性溶液中，进而限制了其应用范围。低分子量的壳聚糖具有许多潜在的应用价值，这是因为其可以在接近生理pH条件下溶解。壳聚糖不仅含有羟基而且含有胺基，因此其可以和硼酸发生可逆反应，这样不需要使用任何催化剂亲水性的壳聚糖就能被修饰上疏水性的硼酸化合物[8]。因此，通过硼酸相关的反应制备基于壳聚糖的自组装材料将更简单可控，而且所产生的硼酯键可以提高组装材料的稳定性。此外，二硫键交联的纳米材料在生物医用领域也有重要的用途。二硫键是一种可被还原的化学键，它在细胞外可以稳定存在，一旦进入细胞内将被还原，这是因为细胞内外还原剂谷胱甘肽的浓度不同。

因此，本文构建了含硼酸的单体MAPBA，并通过RAFT聚合制备含硼酸的均聚物PMAPBA，同时通过CS与NAC反应制备巯基功能化的壳聚糖CS-NAC。由于硼酸与二醇的相互作用及巯基的可氧化性，设计了PMAPBA与CS-NAC组装的纳米粒子，并研究纳米粒子的形貌，CS-NAC的浓度对纳米粒子的粒径、粒径分布及zeta电位的影响。

1 实验

1.1 主要原料与设备

间氨基苯硼酸(分析纯，南京康满林化工实业有限公司)；偶氮二异丁睛(AIBN，分析纯，天津市科汇达化工有限公司)；壳聚糖(CS,Mw = 20000，脱乙酰度86%，浙江玉环县海洋生物有限公司)；N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC，纯度99%，Fluka)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，纯度99%，Sigma产品；1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt，纯度99%，上海延长生化科技有限公司)；其它试剂均为分析纯，使用前未经过处理。

1.2 3-甲基丙烯酰胺基苯硼酸(MAPBA)的合成

将10 mL丙烯酰氯(100.0 mmol)在搅拌下逐渐滴入间氨基苯硼酸(10 g, 64.4 mmol)和NaOH(50 mL, 129.1 mmol)的冷溶液中，滴加时长为30 min，然后在冰盐浴中继续搅拌30 min。撤去冰盐浴，在室温下再搅拌2 h。所得的混合物溶液用1 M HCl调至pH=8，沉淀析出，过滤，用50 mL冷水洗涤5次。真空干燥后将产物溶解到150 mL 5%(V/V)的热乙醇水溶液中，用滤纸过滤除去不溶物。滤液在4℃下静置过夜，最终得到浅褐色针状晶体，过滤，冷冻干燥。产率：45.2%。

1.3 均聚物聚(3-丙烯酰胺基苯硼酸)(PMAPBA)的合成

在50 mL的schlenk瓶中加入单体MAPBA(2.4 mmol)，链转移剂三硫代碳酸酯(DMP，40 μmol)和引发剂AIBN(10.0 μmol)，然后再加入1.0 mL 混合溶剂DMF/H2O(19 ∶1, v ∶v)使上述固体溶解。用橡胶塞塞紧瓶子，通氮气30 min脱氧，然后将schlenk瓶转移至70℃水浴中反应10 h。停止加热，将schlenk瓶放入冰水浴中5 min以终止聚合。将反应液浓缩除去溶剂，然后用少量甲醇溶解，用乙酸乙酯做沉淀剂进行沉淀，得到的固体用丙酮洗涤3次除去未反应的单体，真空干燥，然后溶于二氧六环和水的混合溶剂中，进行冷冻干燥保存。产率：80.4%。合成示意图见图1。

图1 PMAPBA的合成示意图

1.4 壳聚糖-N-乙酰-L-半胱氨酸偶合物(CS-NAC)的合成

将500 mg CS与适量HOBt分散于46 vmL去离子水中，搅拌直至形成透明溶液。加入一定量的NAC，待完全溶解后，逐滴加入EDAC水溶液(4 mL)，用1 mol/L NaOH调节pH至4.0～6.0并保持恒定，于室温下搅拌3 h。取出反应液，于4℃避光条件下用质量分数为0.2% 的乙二胺四乙酸二钠的盐酸(5 mmol/L)溶液透析1次，用质量分数为1%的NaCl的盐酸(5 mmol/L)溶液透析2次，再用1 mmol/L盐酸溶液透析2次，每次透析时间均为12 h。冷冻干燥后得到淡黄色纤维状巯基聚合物，密封后于4℃保存备用。合成示意图见图2。

图2 CS-NAC的合成示意图

1.5 二硫键交联纳米粒的制备

首先，配制不同浓度的CS-NAC水溶液(0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL)，并将5.0 mg的PMAPBA溶于500 μL的无水甲醇中制备10 mg/mL的PMAPBA溶液。接着，将1.0 mL上述不同浓度的CS-NAC溶液中放置在2.0 mL离心管中，在超声的同时将50 μL的PMAPBA溶液慢慢加入到CS-NAC溶液中。滴加结束后，将初步得到的乳白色纳米粒悬浮液，继续在超声环境下超声五分钟。

1.6 仪器及测试

Varian UNITY-plus 400核磁共振波谱仪(美国)；Malvern Nano ZS90 动态光散射仪(英国)。Philips EM400ST 透射电镜(荷兰)

2 结果与讨论

2.1 PMAPBA的表征

2.1.1 MAPBA的核磁共振氢谱

如图3所示，单体MAPBA上甲基的质子峰出现在1.9 ppm处，乙烯基的质子峰出现在5.8和5.5 ppm处，苯环的质子峰在7.9～7.2 ppm范围内，羟基的质子峰出现在8.0 ppm处，亚胺基的质子峰在9.6 ppm处。以上结果证实，MAPBA的成功制备。

图3 MAPBA的核磁共振氢谱

2.1.2 PMAPBA的核磁共振氢谱

图4为均聚物PMAPBA的核磁共振氢谱图。从图中可以看出，PMAPBA聚合物主链上甲基、亚甲基的质子峰出现在1.0～2.4 ppm范围内，PMAPBA中苯环的质子峰在6.9～8.0 ppm。同时，我们可以发现出现在单体MAPBA中的5.8和 5.5 ppm处的乙烯基质子峰在PMAPBA聚合物的核磁氢谱中并没有出现，说明了PMAPBA聚合物的成功制备。

图4 PMAPBA的核磁共振氢谱

2.2 CS-NAC的表征

从CS-NAC的核磁共振氢谱图(图5)可知，与CS相比，CS-NAC在2.9 ppm处新增一明显的特征峰，它是与巯基相连的亚甲基峰，而在2.0～2.1 ppm 处的甲基峰显著增强，也说明NAC已与壳聚糖发生偶合作用(NAC中也含有甲基)。

图5 CS-NAC的核磁共振氢谱

2.3 二硫键交联纳米粒的表征

将上述不同浓度的CS-NAC与固定浓度的PMAPBA制备成纳米溶液。纳米粒子的形成原因有两方面，一方面是PMAPBA中的硼酸基团和CS-NAC中糖环上的羟基或胺基基团相互作用从而产生交联，另一方面，CS-NAC上的巯基基团可在氧气的作用下发生交联作用。通过动态光散射仪测定其粒径(DH)、粒径分布(PDI)和zeta电位，得到数据如下表1所示。通过实验结果可以发现，随着CS-NAC浓度从0.1 mg/mL增加到0.4 mg/mL，所制得的纳米粒子的粒径DH从199.9 nm增加到278.3 nm，但是纳米粒子的粒径增大到270.0 nm左右后，增大的幅度变缓，0.4 mg/mL的CS-NAC制备的纳米粒子仅比0.3 mg/mL的CS-NAC制备的纳米粒子的粒径大7.0 nm。所制得纳米粒子的zeta电位值约为30 mV，且随着CS-NAC浓度的增加，所制得纳米粒的粒径zeta电位值变大，这是因为CS-NAC表面带有大量的胺基，它是带正电荷的。所有纳米粒子的PDI均在0.2左右，表明纳米粒的粒径分布比较均匀。此外，当CS-NAC浓度为0.2 mg/mL时，制备透射电镜样品，观察纳米粒子的形貌。如图6所示，纳米粒子呈现球形，且透射电镜测定的粒径值明显比动态光散射仪测定的粒径值要小，这是因为透射电镜样品是在干态下测定的，而动态光散射仪样品是在溶液状态测定。

表1 不同浓度CS-NAC所制得的纳米粒子的DH、PDI、Zeta电位

CS-NAC(mg/mL)DH(nm)PDIZeta(mV)0 10 20 30 4199 9±6 616255 8±5 142271 9±3 320278 3±2 7150 165±0 0480 211±0 0140 238±0 0320 232±0 03024 1±0 96427 1±0 28929 9±0 28933 3±0 208

图6 纳米粒子的透射电镜图(CS-NAC的浓度为0.2 mg/mL)

3 结论

本文分别制备含硼酸的均聚物PMAPBA和巯基功能化的壳聚糖CS-NAC。将PMAPBA与CS-NAC在氧气环境下组装制备含二硫键的硼酸酯交联的纳米粒子，该类纳米粒子是具有均一的尺寸的球形结构，且随CS-NAC浓度的增加，纳米粒子的粒径及zeta电位增加。

[1] Mun G A, Nurkeeva Z S, Khutorvanskiy V V, et al. Interpolymer complexes of copolymers of vinyl ether of diethylene glycol with poly(acrylic acid) [J]. Colloid Polym. Sci. 2002, 280(3), 282-289.

[2] Galow T H, Boal A K, Rotello V M. A “building block” approach to mixed-colloid systems through electrostatic self-organization [J]. Adv. Mater. 2000, 12(8), 576-579.

[3] Kaczmarek H, Szalla A, Kaminska A. Study of poly(acrylic acid)-poly(vinylpyrrolidone) complexes and their photostability [J]. Polymer，2001, 42(14), 6057-6069.

[4] Roy D, Cambre J N, Sumerlin B S. Sugar-responsive block copolymers by direct RAFT polymerization of unprotected boronic acid monomers [J]. Chem. Commun. 2008, 21, 2477-2479.

[5] Springsteen G, Wang B. A detailed examination of boronic acid-diol complexation [J]. Tetrahedron 2002, 58, 5291-5300.

[6] Ravi K, Majeti N V. A review of chitin and chitosan applications [J]. React. Funct. Polym. 2000, 46(1), 1-27.

[7] Vilivalam V D, Dodane V. Pharmaceutical applications of chitosan [J]. Pharm. Sci. Technol. Tod. 1998, 1(6),246-253.

[8] Sartain F K, Yang X, Lowe C R. Anal. Chem. 2006,78, 5664.

Preparation of boronate crosslinked nanoparticles with disulfide bonds

WANG YAN-xia,WAN Zong-hua,CHAI Zhi-hua

(NorthChinaInstituteofScienceandTechnology，Yanjiao， 101601，China)

In this paper, firstly, poly(3-methacrylamido phenylboronic acid) (PMAPBA) homopolymer were prepared successfully by reversible addition fragmentation chain transfer polymerization (RAFT). Secondly, chitosan-N-acetyl-L-cysteine (CS-NAC) was achieved by the covalent attachment ofN-acetyl-L-cysteine (NAC) to the amine groups of chitosan (CS). Lastly, the boronate crosslinked nanoparticles containing disulfide bonds were formed by the assembly of PMAPBA and CS-NAC under oxygen atmosphere. The results indicated the nanoparticle size and zeta potential increased with the CS-NAC concentration increased. The resulted nanoparticles had a very narrow and monadal size distribution.

boronic acid; reversible addition fragmentation chain transfer polymerization; disulfide bond; nanoparticles

2016-02-13

中央高校基本科研业务费(3142015080)

王彦霞( 1987- ) ，女，山东临沂人，博士，华北科技学院环境工程学院副教授，研究方向: 纳米材料。E-mail: wanglele-108@163.com

TB383

A

1672-7169(2016)02-0085-05