河北省儿童病毒性脑炎和脑膜炎患者埃可病毒6型VP1基因特征分析

郭佳运 陈祥鹏 李静洁 孙素真 谢正德

100045北京，首都医科大学附属北京儿童医院北京市儿科研究所，儿科学国家重点学科，儿科重大疾病研究教育部重点实验室，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室（郭佳运、陈祥鹏、谢正德）；050031石家庄，河北省儿童医院（李静洁、孙素真）

河北省儿童病毒性脑炎和脑膜炎患者埃可病毒6型VP1基因特征分析

郭佳运 陈祥鹏 李静洁 孙素真 谢正德

100045北京，首都医科大学附属北京儿童医院北京市儿科研究所，儿科学国家重点学科，儿科重大疾病研究教育部重点实验室，国家呼吸系统疾病临床医学研究中心，儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室（郭佳运、陈祥鹏、谢正德）；050031石家庄，河北省儿童医院（李静洁、孙素真）

目的阐明河北省儿童病毒性脑炎／脑膜炎患者中埃可病毒6型（Echovirus 6，ECHO6）分离株的基因特征及与国内外其他流行株的进化关系。方法对河北省2013⁃2015年间儿童病毒性脑炎／脑膜炎病例中鉴定为肠道病毒阳性的157份脑脊液标本进行毒株分离，通用引物分段扩增毒株VP1基因获得序列；BLAST比对确定ECHO6毒株，并与来自中国9个省和其他国家的175株ECHO6病毒VP1基因序列进行同源性及亲缘关系分析。结果获得19株ECHO6分离株；我国ECHO6流行株属于C及D基因型，本研究中19株河北分离株分属C及D9c基因亚型。19株分离株间VP1基因核苷酸同源性为79.3%⁃100%，氨基酸同源性为95.8%⁃100%，与原型株（D’Amori）核苷酸和氨基酸同源性分别为76.2%⁃78.3%和92.3%⁃95.1%。VP1基因的序列分析显示，19株ECHO6分别与我国云南、浙江和山东的ECHO6分离株存在较高核苷酸和氨基酸同源性。结论2013⁃2015年间引起河北省儿童病毒性脑炎／脑膜炎的ECHO6病毒流行株主要为C及D9c基因亚型，同时存在多个传播链。

Fundprograms：CapitalClinicalFeatureProjectofBeijingTechnologyProgram（Z151100004015046）；Beijing Outstanding Young Talent Training Projects（2014000021469G237）.

肠道病毒（Enterovirus，EV）属小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属，主要经粪⁃口途径传播，有较强的传染性。EV感染无明显临床表现或症状轻微，但也可引起严重疾病，如急性弛缓性麻痹（Acute flaccid paralysis，AFP）、无菌性脑炎、无菌性脑膜炎、急性出血性结膜炎、心肌炎、手足口病（Hand，food and mouth disease，HFMD）、重症肺炎及新生儿败血症［1］。埃可病毒6型（Echovirus 6，ECHO6）属于EV⁃B组［2］，是引起无菌性脑膜炎及脑炎最常见的病原之一。自2005年我国安徽省首次报道由ECHO6病毒感染所致的儿童病毒性脑膜炎爆发以来［3］，我国山东省、河南省、云南省及湖南省等多地也陆续有相关病例报道［2，4⁃6］。目前我国尚未建立完善的肠道病毒感染监测系统，因而ECHO6病毒在我国的流行情况及基因特征仍需进一步研究。本研究选取河北省儿童医院2013年⁃2015年间病毒性脑炎／脑膜炎患儿脑脊液中分离的ECHO6毒株为研究对象，对其VP1基因进行序列测定和基因特征分析，了解河北省儿童病毒性脑炎／脑膜炎的ECHO6基因分型及变异情况，为ECHO6病毒相关传染性疾病的预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集河北省儿童医院2013年11月⁃2015年10月临床诊断为病毒性脑炎／脑膜炎的住院患儿脑脊液样本492份。

1.2 病毒分离所有样本经Real⁃time PCR核酸鉴定，共检出肠道病毒阳性样本157例。将鉴定为肠道病毒阳性的脑脊液标本接种人横纹肌肉瘤细胞进行毒株分离。

1.3 RNA提取细胞培养物经3次反复冻融后，取病毒上清200 μl，用QIAGEN Viral RNA Mini Kit（QIAGEN，MD，USA）提取病毒RNA，具体步骤详见说明书，从阳性分离物中提取60 μl RNA置－80℃保存。

1.4 病毒VP1全基因的扩增应用引物008⁃013和011⁃012扩增病毒的VP1区［3］。采用One⁃step PCR：Superscript®ⅢOne⁃Step RT⁃PCR System with Platinum®Taq High Fidelity（Invitrogen，CA，USA）。反应体系如下：2X Reaction Mix 10 μl，上下游引物（10pmol／μl）各0.5 μl，RT／Platinum®Taq Mix 1 μl，模板8 μl，反应条件如下：50℃30 min，95℃15 min；94℃30 s，42℃30 s，72℃30 s，共40个循环；72℃延伸10 min。

1.5 ECHO 6 VP1基因序列测定和生物信息学分析经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，阳性扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行序列测定，拼接得到完整VP1基因序列。使用BioEdit（V 7.0.9）软件进行同源性分析，使用Mega（V 6.0）生物软件采用邻接法（Neighbor⁃joining）最大似然法（Maximum⁃likelihood）构建ECHO6 VP1基因亲缘性关系树，进化树可靠性估计bootstrap值设定为1000。

2 结果

2.1 病毒分离鉴定与病例信息经RT⁃PCR扩增、鉴定，得到长度约900 bp的目的基因片段。将序列结果BLAST检索比对后，证实共有ECHO6病毒19株、ECHO30病毒14株、ECHO18病毒8株、CV⁃B5病毒8株、ECHO33病毒6株。对序列进行裁剪，保留完整的VP1基因（867 bp），编码289个氨基酸，无碱基的插入与缺失。

19例ECHO6相关脑炎／脑膜炎病例样本的采集时间为2013年11月⁃2015年7月，有15分样本采集时间集中在4月⁃8月，所有患儿中诊断脑炎2例，其中脑膜炎17例：男11例，女8例，男女比例为1.38∶1；中位年龄5.04岁（1.89岁⁃9.5岁），平均年龄4.97±1.97岁；临床均出现发热症状，其中有10例患儿还出现头痛、9例患儿出现恶心、8例患儿出现呕吐症状；脑炎患儿除发热、头痛、呕吐以外还出现困倦及嗜睡症状。所有患儿预后良好，无死亡及严重后遗症病例。

2.2 ECHO6VP1区系统进化分析为进一步分析ECHO6分离株的基因变异规律以及国内外ECHO6病毒的遗传进化关系，我们将分离出的19株病毒与GenBank获得的来自中国9个省和其他国家地区的175株ECHO6病毒VP1基因序列进行同源性及亲缘关系分析，采用邻接法和最大似然法构建VP1基因系统进化树（图1）。结果显示，194株ECHO6 VP1基因序列在系统进化树上形成A⁃D4个基因型，A基因型包含原型株D’Amori、标准株U16283（U16283）、Burgess（AF081323）、以及Charles（AF465517），B基因型由美国的Cox（AF081322）分离株构成。A、B两基因型均在上世纪50年代的美国流行，近年未见报道。其余毒株属于C、D基因型，C基因型单独由我国山东省、云南省、广东省及河北省等地区1995年⁃2013年的序列组成，型内核苷酸和氨基酸同源性分别为86.8⁃98.6%和93%⁃100%。D基因型序列最多，传播最为广泛，在我国及周边邻国、欧洲、东南亚、北非、地中海等地区均有流行；其核苷酸和氨基酸同源性差异较大，分别为77.1%⁃100%和85.8%⁃100%。根据流行时间、地点及核苷酸同源性其可进一步分为D1⁃D9基因亚型，D9基因亚型又可划分为D9a⁃D9h 8个进化分支，其中D9c分支最大，包括本次除SJZ⁃50以外的所有河北省序列和2008年⁃2013年我国山东省、广东省、云南省等多个地区以及日本、俄罗斯的序列，表明D9c分支在中国多个地区及日本、俄罗斯均引起流行传播。

●：Indicates Hebei strains from meningitis and encephalitis patients图1 ECHO6 VP1基因序列系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of ECHO 6 based on the complete VP1 sequences

构建中国的ECHO6 VP1系统进化树，结果显示（图2），112株ECHO6序列形成两条相互独立的分支，分别属于C、D基因型。其中C基因型主要包括我国山东省、云南省、广东省及本次河北省等地区1995年⁃2013年的序列。D基因型包含三个进化分支，分别对应D2、D6、D9基因亚型，其中D9基因亚型可进一步划分出两条进化分支，分别对应D9b、D9c。1991年⁃2002年11条山东省序列属于D2基因亚型；1条云南省2013年序列属于D6基因亚型；2005年安徽省、2007年云南省及2007、2011年山东省序列均属D9b进化分支中；D9c为我国主要流行亚型，2007年⁃2015年间在我国山东省、广东省、河南省、云南省及台湾等地区均有流行，根据现有数据分析推测，目前中国可能存在多条传播链，其中D9c进化分支作为优势株在我国大陆及台湾地区流行。2.3 ECHO6 VP1区同源性分析将本次分离株与国内外的ECHO6 VP1序列进行同源性对比。结果显示，河北省19株ECHO6病毒分离株之间的核苷酸同源性差异较大，为79.3%⁃100%；氨基酸同源性为95.8%⁃100%。与原型株（D’Amori）的同源性较低，核苷酸和氨基酸同源性分别76.2%⁃78.3%和92.3%⁃95.1%；与2005年我国首次报道的引起安徽省脑炎／脑膜炎暴发的ECHO6 VP1序列对比，核苷酸与氨基酸同源性分别为80.3%⁃86.6%与95.1%⁃97.9%；其中D9c分支中的河北省分离株的核苷酸与氨基酸为92.3%⁃100%和95.8%⁃100%。2014年河北ECHO6分离株SJZ⁃33、63、65、80、81、102、131、144、184及2015年的分离株SJZ⁃265、356与云南省序列334⁃YN⁃CHN⁃2015JK（LC120916）同源性最高，核苷酸同源性为95.8%⁃97.2%，氨基酸同源性为98.6%⁃100%；2014年SJZ⁃75、94及2015年分离的SJZ⁃319与浙江省Zhejiang／CHN／2013（KT633560.1）同源性最高，核苷酸与氨基酸同源性分别为98.2%⁃98.3%、99.6%⁃100%；2013年分离株SJZ⁃2、11及2015年分离株SJZ⁃360、366与云南省序列YN／09AFP／E6（KJ754040.1）的同源性最高，核苷酸与氨基酸同源性分别为96.0⁃96.3%、98.6%⁃98.9%；SJZ⁃50与山东株11298C2／SD／CHN（KJ772474）同源性最高，核苷酸与氨基酸同源性分别为96%、99.3%。根据核苷酸差异＜2%为有直接流行病学联系的判断标准［11］，提示河北省儿童脑炎／脑膜炎患儿ECHO6病毒可能存在多个传播链。

●：Indicate ECHO6 strains isolated in Hebei Province图2 我国ECHO6分离株VP1基因系统进化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the complete VP1 sequences of isolates in China

3 讨论

无菌性脑炎／脑膜炎主要是由肠道病毒引起的中枢神经系统感染性疾病，在世界许多地区均有流行。我国亦有多起肠道病毒脑炎／脑膜炎爆发流行的报道。2002年⁃2003年间浙江省爆发由ECHO30及CVB5引起的脑炎［7］；山东省2003年⁃2009年间报道的三起脑炎爆发分别由ECHO30、CVB3、CVB5引起［8⁃10］；2005年安徽省首次报道了由ECHO6病毒感染所致的儿童病毒性脑膜炎爆发［3］；福建省龙岩市在2004年及2010年报道两起分别由ECHO19、ECHO6引起的脑炎爆发［11，12］；2005年引起甘肃省脑炎流行的病原体为CVA9［13］。

本次实验成功分离EV共55株，ECHO6病毒占34.6%（19／55）、ECHO30病毒占25.5%（14／55）、ECHO18及CV⁃B5病毒各占（14.5%）、ECHO33占（11%），可见ECHO6病毒是引起2013年⁃2015年河北省儿童肠道病毒脑炎、脑膜炎的主要病毒之一。本组研究中ECHO6病毒引起的脑炎、脑膜炎主要发病时间集中在夏秋季，发病地点主要集中在城市周边地区的乡镇及农村，发病人群以学龄前期及学龄期男性患儿为主，主要临床表现脑膜炎以发热、头痛、恶心、呕吐为主，脑膜刺激征及颈项强直不明显；脑炎患儿还可表现困倦、嗜睡等神志改变，所有患儿预后良好，无死亡及后遗症病例。

ECHO6可分为A、B、C和D四个基因型。A、B两基因型均在上世纪50年代的美国流行，已多年未见流行报道；C基因型主要来自我国1995年⁃2013年的流行报道，因在国外未见报道，成为我国独立存在的基因型；D基因型作为目前的优势基因型，在世界各地广泛传播，可分为D1⁃D9基因亚型，D9基因亚型又可进一步划分为D9a⁃D9h。自2005年安徽省在我国首次报道ECHO6脑炎／脑膜炎病例以来，国内陆续报道了多起ECHO6脑炎／脑膜炎流行爆发［4⁃6，14，15］，主要为C、D基因型。本研究获得的19株ECHO6仍属于C、D基因型。因此，根据现有研究报道看，C、D基因型目前是我国ECHO6脑炎／脑膜炎的主要基因型。

对河北省近3年的脑炎／脑膜炎病例脑脊液中共分离得到ECHO6病毒19株的VP1区基因序列分析后发现，相互之间的核苷酸同源性差异较大，为79.3%⁃100%。考虑到肠道病毒的核苷酸进化速度每年1⁃2%［16］，推测本次分离到的19株河北病毒可能不是来源于同一病毒传播链。从VP1系统进化关系来看，10株分离株与云南省流行株334⁃YN⁃CHN⁃2015JK（LC120916）同源性最高；3株与浙江省流行株Zhejiang／CHN／2013（KT633560.1）同源性最高；4株与云南省2009年分离株YN／09AFP／E6（KJ754040.1）同源性最高；1株与山东省流行株11298C2／SD／CHN（KJ772474）同源性最高；提示河北省分离株在进化上不是独立的，与云南、浙江、山东3省份流行株存在共进化和共循环。

因此，本研究提示，2013⁃2015年间河北省儿童病毒性脑炎／脑膜炎ECHO6病毒流行株主要为C及D9c基因亚型，同时存在多个传播链。

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Genetic characterization of Echovirus 6 isolated from meningitis and encephalitis cases in Hebei province，China

Guo Jiayun，Chen Xiangpeng，Li Jingjie，Sun Suzhen，Xie Zhengde

MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children，National Key Discipline of Pediatrics，National Clinical Research Center for Respiratory Diseases，Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection diseases，Beijing Pediatric Research Institute，Beijing Children’s Hospital，Capital Medical University，Beijing 100045，China（Guo JY，Chen XP，Xie ZD）；Children’s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050031，China．（Li JJ，Sun SZ）．

Xie Zhengde，E⁃mail：xiezhengde＠bch．com．cn；Sun Suzhen，E⁃mail：sunsuzhen2004＠126．com

ObjectiveTo analyze the evolution and the genetic characteristics of echovirus 6（ECHO6）isolated from encephalitis／meningitis cases in Hebei province.MethodsCerebrospinal fluid（CSF）sample was collected from encephalitis／meningitis patients at Children’s Hospital of Hebei Province during 2013 to 2015.One hundred and fifty⁃seven CSF specimens，which were positive of human enterovirus confirmed by real⁃time PCR，were submitted to viral isolation.Viral RNA was extracted from positive isolates，and complete VP1 gene was amplified by PT⁃PCR and identified by using BLAST research. Homology comparison and phylogenetic analysis of VP1 gene sequence were performed.Total 175 reference sequences of ECHO6 viruses from nine provinces of China and other countries were downloaded from the GenBank database.ResultsTotal nineteen strains were identified as ECHO6 and these isolates belonged togenotype C and D9c.Homology analysis showed that nucleotide identity was 79.3%⁃100%and amino acid identity was 95.8%⁃100%among 19 isolates.Compared with the prototype strain（D’Amori），nucleotide identity and amino acid identity were 76.2%⁃78.3%and was 92.3%⁃95.1%respectively.ConclusionsGenotype C and D9c were the predominant genotypes of ECHO6 causing encephalitis／meningitis in children in Hebei province during 2013⁃2015.

Children；Encephalitis／meningitis；Echovirus 6；Genetic characteristics

谢正德，Email：xiezhengde＠bch.com.cn；孙素真，Email：sunsuzhen2004＠126.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

儿童；病毒性脑炎／脑膜炎；埃可病毒6型；基因特征

首都临床特色应用研究与成果推广项目（Z151100004015046）；北京市优秀人才培养资助项目（2014000021469G237）

2016⁃07⁃13）