北京市EV⁃D68型肠道病毒引起的急性呼吸道感染

李爱华 张铁钢 李茂中 龚成 罗明 李仁清 张和润 黄芳

100013北京市疾病预防控制中心，北京市预防医学研究中心（李爱华、张铁钢、李茂中、龚成、罗明、李仁清、张和润、黄芳）；100069北京，首都医科大学（黄芳），

·短篇论著·

北京市EV⁃D68型肠道病毒引起的急性呼吸道感染

李爱华 张铁钢 李茂中 龚成 罗明 李仁清 张和润 黄芳

100013北京市疾病预防控制中心，北京市预防医学研究中心（李爱华、张铁钢、李茂中、龚成、罗明、李仁清、张和润、黄芳）；100069北京，首都医科大学（黄芳），

目的了解北京地区呼吸道感染病例中EV⁃D68型肠道病毒感染情况，发现北京地区EV⁃D68型肠道病毒的流行规律，为呼吸道传染病预防控制策略的制定提供依据。方法从监测哨点医院采集呼吸道感染病例的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等标本，利用实时荧光PCR方法，筛查肠道病毒，利用EV⁃D68型肠道病毒特异性引物对肠道病毒核酸检测阳性标本进行RT⁃PCR扩增和测序。测序结果在NCBI中进行BLAST，分析肠道病毒血清型，并进行进化分析。结果从2015⁃2016年6月的10494例呼吸道感染病例病原学标本中，检测到330例肠道病毒核酸阳性标本，其中两例为EV⁃D68型特异性引物扩增阳性，经测序证实其为EV⁃D68血清型。对VP1区的序列进化分析结果表明，两株EV⁃D68肠道病毒均属于3个已知的进化分支中的亚系1。结论北京地区存在EV⁃D68型肠道病毒的流行，并可引起呼吸道感染，流行的EV⁃D68均属于亚系1，与国际上主要流行的亚系一致。本研究结果为阐明EV⁃D68病毒的流行特点提供了数据参考。

Fund programs：National Science and Technology Major Project of China during the 13thFive⁃Year PlanPeriod（2016ZX10004206）；BeijingMunicipalScienceandTechnologyCommission（Z151100003915140）；Capital Medical Development and Scientific Research Fund（2016⁃2⁃3011）

肠道病毒D68（Enterovirus D68，EV⁃D68）属于肠道病毒属、小RNA病毒科D组，可引起呼吸道感染性疾病，在生物学特性上与鼻病毒非常相似［1］。近年来，包括EV⁃D68等新型肠道病毒不断被发现和证实，其引起的疾病也呈现多样化、症状日趋严重的趋势［2］。EV⁃D68由原来仅仅引起散发，引起流鼻涕、咳嗽、呼吸不适等一般感冒症状，到2014年在美国近乎全国暴发流行，出现严重呼吸系统症状，造成1153人感染、13人死亡［3］。从全球的流行趋势来看，EV⁃D68在不同国家、不同地区，均引起越来越多的婴儿、儿童和青少年呼吸道系统急性感染病例。除美国外，菲律宾、日本、荷兰、泰国，近些年均出现EV⁃D68引起的急性呼吸道感染病例［4⁃7］。我国也有EV⁃D68散发感染报道［8，9］。EV⁃D68已引起全世界公共卫生领域的高度关注。

2014年美国多个州暴发EV⁃D68引起的急性呼吸道感染疫情后［3］，我们对北京地区呼吸道感染病例标本进行EV⁃D68的实验室筛查，在一例重症肺炎病例标本中检测到EV⁃D68型肠道病毒［10］，证实北京地区存在EV⁃68的感染。为了明确EV⁃D68在北京地区的流行特点，我们后续开展了持续监测，分析了2015年⁃2016年6月EV⁃D68的流行情况及其分子特征。

1 材料与方法

1.1 监测对象北京市呼吸道多病原监测系统包括30家哨点医院，通过了伦理委员会审查并签署知情同意书，监测诊室包括发热门诊、儿科门诊、儿科病房、急诊、呼吸内科病房和ICU等。对出现发热（腋下体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛、鼻塞、流涕、咳痰等呼吸道感染症状的病例，采集发病一周内咽拭子、痰液及肺泡灌洗液标本。标本采集后在4℃条件下保存，24 h内运送至区县CDC实验室，－70℃以下冰箱保存，其中痰液及肺泡灌洗液标本用Sputasol（Oxid）预先处理后冻存。

1.2 标本病毒核酸提取利用美国应用生物系统公司ABI Mag MAX express 96自动核酸提取仪，采用美国Thermo Fisher公司磁珠法病毒总核酸提取试剂盒（货号：KFR⁃805496），按照试剂盒说明书和仪器操作手册，提取咽拭子和痰液标本中病毒总核酸，用于肠道病毒检测。

1.3 肠道病毒检测用江苏和创生物科技有限公司的肠道病毒核酸实时荧光PCR检测试剂盒（货号：CN09⁃4A），按照试剂盒说明书，进行体系配制和反应条件设置，利用ABI 7500实时荧光PCR仪器，对标本中肠道病毒核酸进行检测。

1.4 EV⁃D68 RT⁃PCR检测合成EV⁃D68特异性引物［11］。选用美国Invitrogen公司GoldScript一步法RT⁃PCR试剂盒（货号：c81401180），按照试剂盒说明书，配制体系和设置反应条件，扩增EV⁃D68的VP1基因，然后对PCR产物进行测序。测序结果在NCBI中，进行核苷酸序列BLAST比对，根据序列比对同源性的高低获得肠道病毒血清型。

1.5 其他呼吸道病毒检测包括流感病毒（新甲型H1N1、甲型H3N2病毒和乙型流感病毒）、副流感病毒1⁃4型、腺病毒、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒（229E、HKU1、OC43和NL63）、鼻病毒和博卡病毒。

1.6 EV⁃D68VP1基因的进化分析利用DNASTAR的MegAlign软件，以ClustalW的方法，构建EV⁃D68的VP1基因进化树，分析其进化关系。

2 结果

2.1 病例标本检测情况2015年1月至2016年6月份，共采集呼吸道多病原监测哨点医院10 494例呼吸道感染病例标本，检测到330例肠道病毒核酸阳性标本，检出率为3.1%；其中2例为EV⁃D68型特异性引物扩增阳性，经测序证实其为EV⁃D68血清型；1例为肺炎病例痰液标本（2016R3061）、1例为上呼吸道感染病例咽拭子标本（2016R3528），年龄分别为7岁、35岁（平均年龄21岁）。2016R3061（GenBank序列号：KX890306）及2016R3528（GenBank序列号：KX890305）阳性产物双向测序，在NCBI的BLAST结果显示，两株病毒与2014年北京在呼吸道病毒标本（GenBank序列号：KP240936.1）中分离的EV⁃D68型肠道病毒高度同源，VP1区序列同源性分别达98%、99%，与急性迟缓性麻痹标本（GenBank序列号：KM892501.1）中分离的病毒同源性分别为95%、96%。两个病例标本其他呼吸道病毒核酸均检测阴性，无混合感染。

本研究检测EV⁃D68型肠道病毒（GenBank序列号分别为：KX890305、KX890306）；●参考株：2014年北京分离病毒（GenBank序列号：KP240936.1）和2013年急性迟缓性麻痹标本分离病毒（GenBank序列号：KM892501.1）；∗既往研究中2011年⁃2014年北京地区分离的13株EV⁃D68毒株。图1 EV⁃D68型肠道病毒V P1序列进化树Strains detected in this study（GenBank ID：KX890305，KX890306）；●Reference strains：strains detected in Beijing and AFP cases（GenBank ID：KP240936.1，KM892501.1）.∗13 EV⁃D68 strains identified in Beijing from 2011 to 2014 in a previous studyFig.1 Phylogenetic tree of EV⁃D68 strains VP1 nucleotide sequences

2.2 EV⁃D68病例临床诊断和症状2016R3061病例为7岁男童，居于北京市海淀区，无其它基础疾病，发病前未接触发热病人及活禽，2016年5月2日发病，5月4日收治北京市海淀医院，诊断为肺炎，胸部影像学检查结果为又下叶渗出／实变，临床症状表现为发热、咳嗽、咳痰等，于12日治愈出院。2016R3528病例为35岁男性，居于北京市石景山区，无其它基础疾病，发病前未接触发热病人及活禽，2016年6月21日发病，22日就诊于北京朝阳医院西区门诊，诊断为急性上呼吸道感染，临床症状表现为发热、咽痛、鼻塞、流涕等。

2.3 EV⁃D68的VP1基因进化分析全球各处所有已知EV⁃D68的VP1基因序列进化分析数据

表明，EV⁃D68可分为3个进化分支：分别为亚系1、2、3［11］。将两株EV⁃D68的VP1区序列与其他国家EV⁃D68的VP1区序列比对，结果如图1所示，两株肠道病毒及与之高度同源的KP240936.1和KM892501株，均属于进化分支中的亚系1。

3 讨论

2014年EV⁃D68在美国多个州的暴发流行，并在全球其他多个国家不断被检出，表明EV⁃D68已成为一种引起呼吸道感染的重要病原体。来自世界不同地方（包括美国、芬兰、法国、荷兰、日本、非洲等）的EV⁃D68型肠道病毒VP1基因序列进化分析结果显示，EV⁃D68病毒被分成3个主要的亚系，分别为亚系1、2、3［12］，有研究中也将其分为A、B、C组［13］。在既往研究中，我们从北京地区2011至2015年呼吸道感染病例中检测到13例EV⁃D68阳性标本，进化分析显示，2011年至2013年的EV⁃D68标本属于亚系1和亚系3，而所有2014年的EV⁃D68均属于亚系1，2011年和2014年同属于亚系1的毒株与美国2014年暴发毒株高度同源［13］。

在本研究中筛查到2例由EV⁃D68型肠道病毒引起的呼吸道感染病例，说明2015年⁃2016年间，北京地区依然存在EV⁃D68病毒的流行。对VP1基因的进化分析表明，其属于进化分支中的亚系1，与北京2014年分离的其他EV⁃D68毒株及美国2014年暴发毒株相似，提示2014年以后北京地区EV⁃D68感染病例以亚系1为主。

EV⁃D68肠道病毒可引起不同人群呼吸系统急性感染病例，以婴儿、儿童和青少年为易感人群。2014年美国多地暴发的EV⁃D68感染疫情主要以婴幼儿为主，菲律宾、泰国等地区由EV⁃D68引起的儿童呼吸道感染比例也明显上升［4，7］。我们在既往研究中检测的13例EV⁃D68感染病例，12例为15岁以下儿童病例，仅1例为成人感染［10，13］。此外，Xiang［9］等在2006⁃2010年北京协和医院发热门诊患者呼吸到分泌物中检测到13例EV⁃D68感染的成人病例。本研究在成人中也检测到EV⁃D68病毒感染，但症状比儿童感染病例略轻。提示随着EV⁃ D68的不断出现，也可能在成人中引发疾病并不断传播，需要引起一定关注。我们的呼吸道监测系统能够敏感、全面、快速的监测到EV⁃D68病毒引起的感染病例，其传播和治病机制需进一步研究。

目前，EV⁃D68的感染呈散发，病例间未有流行病学关联，未发现有聚集性病例。但当前流行的亚系与全球流行的主要型别一致，提示仍要加强对北京市呼吸道感染病例EV⁃D68肠道病毒的监测，及时发现可能的聚集性病例，及早采取措施，避免出现大规模流行。进一步了解和揭示各种型别肠道病毒在北京地区的流行趋势，也有助于掌握肠道病毒的流行规律，为相关疫情的预警和防控提供数据支持。

［1］ Oberste MS，Maher K，Schnurr D，et al.Enterovirus 68 is associated with respiratory illness and shares biological features with both the enterovirusesand the rhinoviruses［J］.J Gen Virol，2004，85（Pt9）：2577⁃84.doi：10.1099／vir.0.79925⁃0.

［2］ 孙毅.靳艳.黄卫东，等.肠道病毒脑炎39例病原学及影响其预后的相关因素分析［J］.中国小儿急救医学，2006，13（2）：154⁃155.doi：10.3760／cma.j.issn.1673⁃4912.2006.02.027.

［3］ Midgley CM，Jackson MA，Selvarangan R，et al.Severe Respiratory Illness Associated with Enterovirus D68⁃Missouri and Illinois，2014［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2014，63（36）：798⁃799.［4］Imamura T，Fuji N，Suzuki A，et al. Enterovirus 68 among children with severe acute respiratory infection，the Philippines［J］.Emerg Infect Dis，2011，17（8）：1430⁃5.doi：10.3201／eid1708.101328.

［5］ Ikeda T，Mizuta K，Abiko C，et al.Acute respiratory infections due to enterovirus 68 in Yamagata，Japan between 2005 and 2010［J］.Microbiol Immunol，2012，56（2）：139⁃43.doi：10.1111／j.1348⁃0421.2012.00411. x.

［6］ Meijer A，van der Sanden S，Snijders BE，et al.Emergence and epidemic occurrence of enterovirus 68 respiratory infections in The Netherlands in 2010［J］.Virology，2012，423（1）：49⁃57. doi：10.1016／j.virol.2011.11.021.

［7］ Linsuwanon P，Puenpa J，Suwannakarn K，et al.Molecular epidemiology and evolution of human enterovirus serotype 68 in Thailand，2006⁃2011［J］.PLoS One，2012，7（5）：e35190. doi：10.1371／journal.pone.0035190.

［8］ Xiang Z，Gonzalez R，Wang Z，et al.Coxsackievirus A21，enterovirus 68，and acute respiratory tract infection，China［J］. Emerg Infect Dis，2012，18（5）：821⁃4.doi：10.3201／eid1805.111376.

［9］ Lu QB，Wo Y，Wang HY，et al.Detection of enterovirus 68 as one of the commonest types of enterovirus found in patients with acute respiratory tract infection in China［J］.J Med Microbiol，2014，63（Pt 3）：408⁃14.doi：10.1099／jmm.0.068247⁃0.

［10］ 张铁钢，罗明，李爱华，等.北京市一例重症肺炎儿童的呼吸道中检出肠道病毒D68［J］.中华 预防医学杂志，2015，49（3）：282⁃283.doi：10.3760／cma.j.issn.0253⁃9624.2015. 03.019.

［11］ Rafal T，Cadhla F，Shabir A，et al.Worldwide emergence of multiple clades of enterovirus 68［J］.J Gen Virol，2012，93（Pt 9）：1952–1958.doi：10.1099／vir.0.043935⁃0.

［12］ Imamura T，Oshitani H.Global reemergence of enterovirus D68 as an important pathogen for acute respiratory infections［J］.RevMed Viol，2015，25（2）：102⁃114.doi：10.1002／rmv.1844.

［13］ Zhang T，Li A，Chen M，et al.The respiratory infections associated with enterovirus D68 from 2011 to 2015 in Beijing，China［J］.J Med Viol，2016，88（9）：1529⁃34.doi：10.1002／ jmv.24505.

Acute respiratory tract infections associated with Enterovirus D68 in Beijing

Li Aihua，Zhang Tiegang，Li Maozhong，Gong Cheng，Luo Ming，Li Renqing，Zhang Herun，Huang Fang

Beijing Center for Disease Prevention and Control．Beijing Preventive Medicine Research Center，Beijing 100013，China（Li AH，Zhang TG，Li MZ，Gong C，Luo M，Li RQ，Zhang HR，Huang F）；Capital Medical University，Beijing 100069，China（Huang F）

Huang Fang，Email：hfxdd1775＠yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the respiratory infection associated with enterovirus D68 in Beijing，learn the epidemic regularity of enterovirus D68，and provide scientific basis for the work of respiratory illness prevention and control.MethodsWe collected the oropharyngeal swabs，sputum and alveolar lavage fluid from the respiratory illness cases in monitoring sentinel hospitals.The Enterovirus was detected by real⁃time RT⁃PCR.The gene fragments of enterovirus specimens were amplified by a pair of specific primers for enterovirus D68.The sequences were analyzed in NCBI by BLAST method to determine the serotype and genetic analysis.ResultsIn total of 10 494 specimens from respiratory illness cases，330 cases were positive for enterovirus.Of the 330 cases in whom enterovirus was confirmed，two cases were associated with enterovirus D68 by RT⁃PCR test.The sequences of PCR products further confirmed that the two viruses were enterovirus D68.Alignment of phylogenetic analysis of VP1 gene sequences showed that these viruses clustered and belonged to clade lineage 1.ConclusionsThe study confirmed that there were respiratory illness cases infected by enterovirus D68 in Beijing.The EV⁃D68 strains since 2014 all belonged to lineage 1，which was the dominant sublineage epidemic worldwide.

Acute Respiratory tract infections；Enterovirus D68；VP1 gene

黄芳，Email：hhffxdd＠126.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

急性呼吸道感染；肠道病毒D68型；VP1基因

国家“十三五”科技重大专项（2016ZX10004206）；北京市科学技术委员会（Z151100003915140）；首都医学发展科研基金（2016⁃2⁃3011）

2016⁃10⁃24）