隐匿性感染的慢性乙型肝炎患者HBV S基因分析

黄象艳 石庆芬 刘超 李杰 刘国梅 冀春红 张新萍 张丽 黄涛

250031济南军区总医院输血科（黄象艳、刘超、李杰、刘国梅、冀春红、张新萍）；济南市传染病医院（石庆芬）；山东省疾病预防控制中心（张丽、黄涛）

隐匿性感染的慢性乙型肝炎患者HBV S基因分析

黄象艳 石庆芬 刘超 李杰 刘国梅 冀春红 张新萍 张丽 黄涛

250031济南军区总医院输血科（黄象艳、刘超、李杰、刘国梅、冀春红、张新萍）；济南市传染病医院（石庆芬）；山东省疾病预防控制中心（张丽、黄涛）

目的研究慢性乙型肝炎（CHB）患者中隐匿性乙肝病毒（HBV）感染的特点，分析S基因突变及发生隐匿性感染的可能原因。方法收集CHB患者经治疗后血清学HBsAg检测结果转为阴性而HBV DNA阳性的标本10例。采用实时定量PCR进行HBV DNA定量检测。PCR扩增HBV S区基因，并进行克隆测序。结果10例标本ALT均正常（23.3±13.3U／L），定量和定性试剂检测血清学HBsAg结果均为阴性，HBV DNA定量结果均为阳性且病毒载量相对偏低（中位数：4.82×104copies／mL）。经S基因测序分析，10例标本均存在S区基因突变，其中8例标本存在不同突变株或突变株与野生型的混合感染，突变频率较高的位点为T47A、L98V、I／T126N／S、T131N、M133T／I、W172∗、M198I、W199∗、N207T。结论CHB患者经过抗病毒治疗后HBsAg转为阴性的病例中存在隐匿性HBV感染，发生隐匿性感染可能与HBV S基因突变或循环HBsAg低于检测限有关，使用敏感度高的试剂进行HBV DNA检测有利于CHB患者治疗后隐匿性HBV感染的发现。

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）呈世界性流行，不同地区流行程度差异较大，中国属于HBV感染高流行地区。世界上约有3.5亿患者慢性感染HBV［1］，最新血清流行病学调查显示，中国成年人HBsAg携带率仍处于较高水平［2］，中国慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者的数量占世界总数的比例较高。根据HBV感染者的血清学、病毒学、生物化学试验及其他临床和辅助检查结果，诊断CHB主要包括血清HBsAg阳性、HBV DNA阳性，血清ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变。治疗过程中血清HBsAg水平的下降速度可预测CHB患者抗病毒治疗的持续病毒学应答及治疗结束后HBsAg的血清学转换［3］。理想的治疗终点是HBsAg低于检测下限，往往预示炎症缓解、远期预后改善。但值得注意的是在CHB患者中存在隐匿性HBV感染（Occult HBV infection，OBI）［4，5］，HBsAg转为阴性并不意味着HBV的彻底清除。

OBI是指商品试剂盒不能检出血清HBsAg，而在外周血或肝脏组织中可以检测到HBV DNA的HBV感染。S基因编码226个氨基酸的S蛋白，是血清学HBsAg检测的主要靶点。S基因突变可能是OBI发生的重要原因［6］，S基因突变尤其是主要亲水性区域基因突变可能会影响特异性抗体的结合；S基因突变也可通过降低S蛋白的合成或分泌影响HBsAg的表达。本研究对CHB患者治疗后发生OBI进行研究，分析S基因序列，探讨CHB患者中OBI形成的可能原因。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 标本收集：经医院医学伦理委员会批准，收集济南市传染病医院2012年2月到2013年4月CHB患者（诊断标准：HBsAg阳性、HBV DNA阳性，血清ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变）经常规治疗（保肝、降酶、抗病毒治疗）后HBsAg转为阴性而HBV DNA阳性的血液标本10例（N1⁃N10），查阅并整理10例标本所对应患者的临床资料。血清标本实验前储存于－80℃。

1.1.2 主要试剂与仪器：HBsAg定量和定性检测试剂盒分别购自雅培公司和英科新创（厦门）科技有限公司；HBV PCR荧光定量检测试剂盒购自上海科华生物技术公司；实时定量PCR仪为罗氏Light Cycler实时定量PCR仪；QIAamp MinElute病毒核酸提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；引物由大连TaKaRa公司合成；Prime STAR高保真DNA聚合酶、DNA胶纯化试剂盒等购自大连TaKaRa公司；PCR扩增仪为BIORAD MyCycler梯度PCR扩增仪。

1.2 实验方法

1.2.1 HBsAg定量和定性检测：采用商品化HBsAg定量和定性检测试剂盒，检测收集血清标本中HBsAg结果。

1.2.2 HBV DNA提取：使用QIAamp MinElute病毒核酸提取试剂盒从200 μl血清标本中提取病毒DNA，操作完全按照试剂盒内说明书进行。提取的DNA－20℃保存备用。

1.2.3 HBV DNA定量检测：HBV DNA采用实时荧光PCR定量检测，操作完全按照试剂盒说明书进行，并在实时定量PCR仪上对结果进行检测和计算。

1.2.4 引物设计：根据本地区HBV主要基因型（B型或C型）标准序列，使用软件Primer Premier 5分析后设计正向引物1条（F：5′⁃ATGGAGAACACAAC ATCAGG⁃3′），反向引物1条（R：5′⁃AATGTATACCC AAAGACAAAAG⁃3′）。F和R扩增片段为678 bp，扩增产物为S基因产物。

1.2.5 PCR扩增：使用Prime STAR高保真DNA聚合酶在PCR扩增仪上进行目的片段扩增。25 μl PCR反应体系中加入上述提取的模板DNA 2 μl。反应条件如下：94℃热变性1.5 min后进入40个扩增循环，循环条件：98℃变性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min。

1.2.6 DNA测序：PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，使用胶纯化试剂盒切胶纯化，纯化步骤按试剂说明书进行。PCR纯化产物进行克隆测序，每个标本挑选5个克隆，每个克隆中得到的DNA均送至大连TaKaRa公司和上海生工公司进行测序。

1.2.7 HBV基因分型：根据HBV S基因测序结果进行基因分型。将得到的HBV S区基因序列在NCBI网站（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／projects／genotyping／）上与参考序列比对，确定基因型。

1.2.8 序列分析：使用NCBI网站（http：／／blast. ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）在线进行核酸和氨基酸序列分析，与对应基因型标准序列（AB014381）及S蛋白标准序列（BAA32914）比较，以分析S基因突变。

2 结果

2.1 OBI患者治疗前临床资料10例标本对应的患者治疗前血清ALT水平均高于正常值（146.7± 130.2 U／L），HBsAg定性检测均为阳性。

2.2 隐匿性HBV患者血清学检测结果及HBV DNA定量检测结果10例标本治疗后ALT均为正常（23.3±13.3 U／L），HBsAg定量及定性检测均为阴性，DNA载量在1.02×103⁃4.70×105copies／mL，见表1。

表1 10例患者治疗后血清学及分子生物学特征Tab.1 Serologic and Molecular Characteristics of 10 patients after Treatment

2.3 S基因PCR扩增和基因型10例标本经扩增后测序得到S基因序列，经与标准序列比较，均为基因型C。

2.4 测序结果分析10例标本的所有克隆测序结果与相应基因型（C型）参考序列比对，主要突变位点检出的数量见图1，各标本突变位点见表2。

3 讨论

CHB患者经过抗病毒治疗HBsAg转为阴性往往被认为是预后良好，但是CHB患者中存在的隐匿性HBV感染不容忽视。隐匿性HBV感染被认为与肝病的进展有关，有研究［5，7］表明HBsAg阴性的CHB患者中发生隐匿性HBV感染可以导致肝硬化或者发展为肝癌，一旦在CHB患者中存在隐匿性病毒感染，显性HBV感染对肝脏造成严重损害的表现形式会以更隐蔽的方式延续。本研究中挑选的10例标本HBsAg定量和定性检测均为阴性，而HBV DNA均为阳性，在血清中检测到病毒DNA，充分说明CHB患者HBsAg转为阴性后存在隐匿性感染的可能。治疗后ALT水平恢复正常与保肝降酶治疗以及HBV载量的下降有关，但隐匿性HBV感染的建立对肝炎预后的影响不容忽视。与HBsAg阳性CHB患者相比，隐匿性HBV感染患者病毒载量相对偏低［6］，CHB患者经治疗转为HBsAg阴性后应使用高敏感性的试剂进行HBV DNA定量检测，以排除隐匿性感染的可能。

表2 隐匿性HBV中S蛋白突变分析Tab.2 Mutations within S protein in OHB

造成隐匿性HBV感染的因素很多，S基因突变被认为是一个主要原因［6］。S基因突变可以导致抗原决定簇构象改变而检测抗体不能结合；另外，S基因突变也会影响抗原的合成和分泌从而导致血清中抗原的检测量低于检测限。本研究通过基因测序，从基因水平剖析发生HBsAg漏检的原因。研究结果显示10个标本中均存在S基因突变（表2，图1），突变频率较高的位点主要有T47A、L98V、I／T126N／S、T131N、M133T／I、W172∗、M198I、W199∗、N207T。S基因a决定簇（aa124⁃147）内的位点突变包括I／T126N／S、T131N、M133T／I，这些位点的突变在隐匿性HBV感染中的作用可能使抗原表位构象变化导致特异性抗体不能正常结合，也可能造成表面抗原合成和分泌减少［8］。虽然S基因主要亲水性区域（MHR）的基因突变一般被认为是HBsAg检测失败的原因，但本研究显示大多数突变位点发生在MHR之外，这与健康人中存在的隐匿性感染不同，可能与抗病毒治疗有关。有研究［9⁃11］报道乙型肝炎抗病毒治疗后出现L98、W172、M198、W199等位点的突变，这些突变可能会导致S蛋白抗原性的改变并影响商品化试剂盒的检测。本研究中10例病例的主要抗病毒治疗方案是干扰素治疗，以往的研究［9，10，12］中报道较多的是核苷（酸）类似物治疗后HBV基因突变的情况。采用不同的治疗方案，发生S基因突变的位点有相似之处，也有不同之处。CHB患者中不同治疗方案与S基因位点突变和OBI发生率的相关性尚有待于进一步研究。

“∗”代表终止密码子图1 隐匿性HBV感染标本中S基因主要突变位点检出数量“∗”represents the stop codonFig.1 Number of main point mutations detected within S gene in the occult HBV infection samples

从不同克隆的测序结果分析（表2），标本N6和N7的5个克隆测序结果一样，但其余8个标本均存在混合感染，即不同突变株的混合感染或者突变株与野生型的混合感染。突变株的混合感染说明病毒在治疗的过程中发生了不同位点的突变，混合感染可能在多个途径影响HBsAg的检测，其相关机理还有待于进一步研究。标本N2、N4、N8存在野生型的混合感染，虽然存在野生型克隆，但是商品化试剂盒常规还是不能检测到血清HBsAg，这也从另一个侧面说明隐匿性HBV感染除了与S基因突变有关，和抗原的合成分泌降低至检测限以下有关。循环中可检测蛋白的低水平会导致病毒逃避商品化HBsAg试剂盒的检测，发生检测失败。

综上所述，CHB患者经抗病毒治疗后HBsAg转阴可能存在隐匿性HBV感染，不能忽视其对患者的潜在威胁。S基因突变是CHB患者发生隐匿性感染和实验诊断漏检的主要原因，但并不是唯一原因。CHB患者治疗后使用敏感性较高的HBsAg和DNA诊断试剂进行检测有重要意义。

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Analysis of hepatitis B virus S gene in occult infection among patients with chronic hepatitis B

Huang Xiangyan，Shi Qingfen，Liu Chao，Li Jie，Liu Guomei，Ji Chunhong，Zhang Xinping，Zhang Li，Huang Tao

Department of Blood Transfusion，General Hospital of Jinan Military Command，Shandong 250031，China（Huang XY，Liu C，Li J，Liu GM，Ji CH，Zhang XP）；Jinan Infectious Disease Hospital，Shandong，China（Shi QF）；Shandong Center for Disease Control and Prevention，China（Zhang L，Huang T）

Huang Xiangyan，Email：xiangyan73＠aliyun．com；Huang Tao，Email：huangtao29＠163．com

ObjectiveTo further explore the occult hepatitis B virus（HBV）infection in patients with chronic hepatitis B（CHB）and analyze S gene mutations and the possible reasons of occult infection.MethodsSera of 10 CHB patients carrying HBsAg negative with HBV DNA positive after treatment were collected.Real⁃time polymerase chain reaction（PCR）was used.S gene amplification products were obtained by PCR，and clonal sequencing were then used for these samples.ResultsIn 10 samples，ALT results were normal（23.3±13.3U／L），serological HBsAg results were negative by qualitative and quantitative reagents.HBV DNA quantitative results of 10 samples were positive and low（mean：4.82×104copies／mL）.Sequencing disclosed S gene mutations in all 10 samples.Among them，co⁃existences of the different mutants or mutants with wild⁃type were found in 8 samples.The mutation points with high frequency included T47A、L98V、I／T126N／S、T131N、M133T／I、W172∗、M198I、W199∗、N207T.ConclusionsOccult HBV infection existed in CHB patients after treatment.Factors contributing to the occult HBV infection include S gene mutations and low levels of circulating antigen which are below the assay limit of detection.The use of highly sensitive reagents for HBV DNA detection is beneficial to the detection of occult HBV infection in CHB patients after treatment.

Hepatitis B virus（HBV）；Occult infection；Chronic hepatitis B；S gene mutationsFund program：National Natural Science Foundation of China for Young Scholars（81101321）

黄象艳，Email：xiangyan73＠aliyun.com；黄涛，Email：huangtao29＠163.com

10.3760／cma.j.issn.1003⁃9279.2016.06.000

肝炎病毒，乙型；隐匿性感染；乙型肝炎，慢性；S基因突变

国家自然科学基金青年基金（81101321）

2016⁃10⁃01）