非水酶催化及其在香精香料合成中的应用
2016-02-04张志国田鑫陈媛孙迪
张志国，田鑫，陈媛，孙迪
(齐鲁工业大学 食品科学与工程学院，济南 250353)
非水酶催化及其在香精香料合成中的应用
张志国*，田鑫，陈媛，孙迪
(齐鲁工业大学 食品科学与工程学院，济南 250353)
概述了非水酶催化的历史、非水酶催化的优点，阐述了有机溶剂、离子液、SCF等非水酶催化的介质，最后就利用非水介质酶催化短链芳香酯、芳香内酯、香兰素等香料的合成进行了综述。
非水酶；催化；香料
在非水介质中进行酶催化反应的研究称非水酶学(Non-aqueous Enzymology)。非水酶学是近年来酶学研究领域的一个重要分支，非水介质酶催化是目前生物技术、有机合成等领域的前沿性课题之一。传统观点认为酶只能在水溶液环境中进行催化，但近年来的研究证明，酶在非水介质中仍可表现出催化活性，并且表现出在水介质中所不具有的特有的催化特性。非水介质酶催化的用途很多，近年来其在香精香料的制备中有了一定发展。
1 非水介质酶催化的历史
早在1936年，美国华沙大学的Sym就在BiochemistryJournal上报道了酯酶在有机溶剂中的催化作用[1]，但当时由于对此存在争议，未能引起有关学者进行进一步研究的兴趣。1977年，前苏联的Klibanov在“水-非水溶性有机溶剂”两相体系中，用胰蛋白酶合成了L-色氨酸乙酯，结果表明在水反应体系中，酯的产率仅有0.01%，在“水-非水溶性有机溶剂”两相体系中，酯的产率接近100%，证实了在接近无水的条件下，有利于酯化反应的进行[2]。1984年，他又与Zaks合作，在Science上发表了一篇关于酶在有机介质中的催化作用的论文。他们在仅含微量水的有机介质(Microaqueous Media)中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物，并证实了酶在100 ℃高温下，不仅能够在有机溶剂中保持稳定，而且还显示出很高的催化转酯活力[3]。他们的发现在世界范围内引起了对非水介质酶催化的兴趣，这一发现为酶学研究和应用带来了一次革命性飞跃，打破了传统的生物催化概念，将酶引入非水介质中，并成为酶学和有机合成研究中一个迅速发展的新领域，开辟了酶学研究领域的另一个重要分支——非水酶学，开启了非水酶学研究的先河。
1987年，中国科学院上海生化所黄中祥[4]在我国首先进行了有机溶剂中酶催化反应的报道。之后，吉林大学酶工程实验室的罗贵民[5]、湖北大学的曾和平[6]陆续进行了非水介质中酶催化反应的报道，但这些都仅限于综述性的报道。直到1991年，曹淑桂等[7]报道了猪胰脂肪酶在冻干时的pH值、有机溶剂的极性、反应系统的含水量、温度以及底物碳链的长度和支链对酶在有机相中催化活性的影响规律，并利用该酶合成了具有玫瑰香味的月桂酸香茅酯和辛酸香茅酯。此后，在我国真正意义的非水酶催化研究才陆续展开。
2 非水介质酶催化的优点
非水相中的酶催化之所以引起人们如此大的兴趣，是因为酶在有机溶剂中表现出了全新的性质。例如酶在非水相中可以催化许多在水相中不可能进行的反应，而它本身却十分地稳定。与在水相中进行的酶促反应相比，非水相酶催化具有以下优点：有利于疏水性底物的反应；可提高酶的热稳定性；能催化在水中不能进行的反应；可改变反应平衡移动方向；可控制底物专一性；可防止由水引起的副反应；可扩大反应pH值的适应性；酶和产物易于回收；可避免微生物污染[8，9]。
3 非水介质的类型
近年来，对酶在非水介质中的催化作用的研究日趋增多，从最早的以有机溶剂作为非水介质，发展到离子液[10]、超临界流体[11]等作为酶反应的介质，值得注意的是非水介质并非绝对无水，由于酶需要有一定量的水来维持其催化活性。在非水酶学研究中，存在一种共识，在非水或低水环境中，只要酶分子的“必需水”层不被剥除，酶就可以有效地发挥其催化作用，这种与水溶液环境相差很大的酶催化反应环境称为“非水相”或“非水介质”。
3.1 有机溶剂
在非水介质酶学研究中，以有机溶剂作为反应介质是研究最早、也是研究最多的一种非水介质，所以，常将以有机溶剂作为反应介质的酶催化称为有机介质中的酶催化。Zaks提出了非水相酶学的一个具有普遍意义的定律：作为反应介质，非极性溶剂优于极性溶剂。由于极性溶剂，特别是与水互溶的有机溶剂会争夺，甚至剥除蛋白质分子的“必需水”层，扰乱酶分子天然构象的形成。这一说法确实可以作为 Zaks定律的一个合理解释。Zaks和 Klibanov检测了在各种溶剂中水对醇脱氢酶、醇氧化酶及多酚氧化酶活性的影响，结果表明：有机溶剂是通过与酶分子周围的水层而不是酶分子本身发生作用的。他们还发现，随着增加溶剂中的水含量，酶的活力迅速增加。表达有机溶剂对酶催化活力影响的一个比较准确，或者说是较为有意义的术语是溶剂“扭曲(或扰动)”酶的水结合区的能力，即有机溶剂穿透并进入催化剂的“必需水”层，或将“必需水”推开或拉脱的能力。溶剂的这种水扰动能力与其性质密切相关。Laane等深入研究了107 种溶剂的理化性质与酶功能的相关性，其中包括 Hildebrand(希尔德布兰德)溶解度参数(δ)、介电常数(ε)、偶极矩(μ)以及疏水常数(log P，辛醇-水双相体系中的分配系数)，发现log P与酶活力之间具有最好的相关性，用log P表征溶剂极性时，酶活性与溶剂极性之间具有更好的相关性，发现酶催化活性与溶剂疏水常数之间的关系是一条S 形曲线，在log P<2的极性溶剂中的催化活性较低，在2
3.2 离子液
离子液体一般是指由体积相对较大的有机阳离子和体积相对较小的无机或有机阴离子构成、在室温或近于室温下呈液态的物质，是一种低熔点的盐(<100 ℃)。与常规的有机溶剂不同的是，离子液没有蒸汽压，能够溶解多种物质，可溶解一般有机溶剂不能溶解的底物，并且可以和多种溶剂形成两相体系，具有低毒、稳定、不挥发等特点,被称为绿色反应介质。离子液体可提高酶的稳定性，维持酶的催化活性[13]。由于离子液所具有的独特性质，使其成为一种生物催化反应的理想溶剂。但是，目前离子液的价格还很高，价格因素将限制其在大规模生产中的应用。
3.3 超临界流体
超临界流体指温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力；然而其扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。超临界CO2是应用最广泛的超临界流体，它不但具有超临界流体的一般特性，而且还具有无毒、无害、不燃烧、无污染、容易回收和可循环利用等特点，是环境友好的绿色溶剂。但是超临界CO2作为非水酶催化的反应介质仅限制在以低极性的底物的作为反应底物催化反应中[14]。
4 非水酶催化在合成香料中的应用
4.1 短链芳香酯的合成
短链芳香酯类香料是日化香精和食用香精的调香配方中十分重要的香料品种,应用十分广泛。传统短链芳香酯类香料的合成方法主要是醇和有机羧酸之间的直接酯化法。使用最多的是以成本低廉的浓硫酸作催化剂，由于该工艺存在设备腐蚀、环境污染、生产周期长、副反应较多、后处理操作比较复杂、费时费料等一系列不足,与食用安全、绿色化学和清洁生产要求格格不入,因此急需开展新工艺技术的研究开发和应用。在非水介质中使用脂肪酶催化酯化反应生产食用香料是一个很好的选择。Maha等利用脂肪酶催化合成了戊酸乙酯(青苹果味)和乙酸己酯(桃子味)[15]。Gubicza等利用Novozyme 435脂肪酶催化合成了乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丙酸异戊酯、丁酸乙酯、丁酸异戊酯等短链芳香酯[16]。Rajnish等以超临界CO2作为反应介质进行了脂肪酶催化不同脂肪酸与异戊醇发生酯化反应形成不同种香料的研究[17]。Rachna等利用固定化玫瑰酵母以异辛烷作为反应介质合成了己酸乙酯[18]。
4.2 芳香内酯的合成
芳香内酯是羟基脂肪酸分子经过分子内酯化形成的化合物，具有浓郁的香气，在各种具有水果味、可可味、奶酪味及坚果味的食品中都曾分离得到γ-内酯和δ-内酯，而某些大环ω-内酯具有珍贵的麝香香味，它们在食品和化妆品工业中有重要应用价值。Ahmed等利用来自洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)的脂肪酶催化合成了γ-内酯和δ-内酯[19]。沈芳等利用固定化Candidasp.GXU08 菌株产脂肪酶催化15-羟基十五烷酸甲酯合成环十五内酯(δ-内酯)[20]。
4.3 香兰素的合成
香兰素是在食品、香水、制药等行业被普遍应用的香料之一。1816年，香兰素第一次被从香荚兰豆荚中分离得到，其结构在1874年被确定。如今，全世界的香兰素消耗量每年大约在12000吨，大约有50吨的天然香兰素来自香兰豆荚，其余的来自化学合成。由于香兰豆荚的来源有限，受产地、天然等因素的影响，成本高致，使天然香兰素的价格昂贵。尽管如此，利用植物提取法生产的天然香兰素无法满足市场的需求，再加上美国和欧盟等标准中规定，化学合成的风味物质不能用作天然风味，使研究者越来越感兴趣于利用其他的天然资源，如利用生物技术来生产天然香兰素。近年来对微生物转化法生产香兰素的研究较多，但一般情况下香兰素只是中间代谢产物，会继续降解而不易积累。因此，除了继续设法寻找可在代谢途径中积累香兰素的菌株外，用酶转化法生产香草醛是近年来又一个很有前景的研究方向[21]。Mane等利用大豆脂氧合酶将异丁香酚转化为香兰素[22]，并申请了美国专利。李永红等也在利用大豆脂氧合酶法转化异丁香酚制备香兰素方面获得了成功[23]。
4.4 其他应用
酶作为高效的生物催化剂，还可以进行光学活性物质的拆分或合成。薄荷醇，其俗名为薄荷脑，又名六氢百里香酚，是一类非常重要的香料，被广泛用于食品、医药、日化等行业，是一个典型的被酶有效拆分的香料。薄荷醇分子中存在3个手性中心，理论上有8个立体异构体，各具有不同的物理性质，在8个立体异构体中，只有D-薄荷醇和L-薄荷醇具有应用价值，L-薄荷醇具有特有的薄荷香气并有强烈的清凉作用，而D-薄荷醇却无清凉作用，而且还具有辛辣刺激性气味，微带樟脑气味。正是由于这些差异，使得L-薄荷醇比D-薄荷醇有更高的应用价值，所以要对其进行手性拆分。Elisabetta等用脂肪酶对薄荷醇的消旋混合物成功地进行了拆分[24]。
奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之一，主要用于冷食、糖果、饮料等的增香。武彦文等利用脂肪酶对不同类型的奶油、奶酪和牛奶等进行酶解，以乙醇或丙酮为溶剂在非水介质下得到了奶香浓郁、赋香效果明显的奶味香精[25]。
5 结束语
非水相酶催化是目前生物技术中的前沿性课题之一，其在香精香料中的应用研究正在日益开展，尽管某些产品还仅限于在实验室中进行，但随着非水酶学的研究深入，目前非水酶催化反应研究已取得了较大发展，相信今后会有更多的香精香料产品实现非水酶催化的规模化今后工业生产。
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Non-aqueous Enzymatic Catalysis and Its Application in Synthesis of Flavors and Fragrances
ZHANG Zhi-guo*, TIAN Xin, CHEN Yuan, SUN Di
(College of Food Science and Engineering, Qilu University of Technology, Ji'nan 250353, China)
Summarize the history and advantages of non-aqueous enzymatic catalysis; expound the non-aqueous medium of enzymatic catalysis such as organic solvent, ionic liquid, SCF and so on. Finally, review the synthesis of short chains of aromatic esters, aromatic lactone, vanillin and other spices catalyzed with non-aqueous medium enzymes.
non-aqueous enzyme; catalysis; spices
2016-06-15 *通讯作者
张志国(1974-)，男，副教授，博士，主要从事食品资源开发方面的研究； 田鑫(1992-)，男，硕士，主要从事食品资源开发方面的研究。
TS202.3
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.031
1000-9973(2016)12-0134-04
