食品及调味品中罂粟成分的实时荧光PCR检测方法

高琴，宗凯，杨捷琳*， 潘良文

(1.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.安徽出入境检验检疫局技术中心，合肥 230022)

食品及调味品中罂粟成分的实时荧光PCR检测方法

高琴1，宗凯2，杨捷琳1*， 潘良文1

(1.上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.安徽出入境检验检疫局技术中心，合肥 230022)

针对食品及调味品非法添加罂粟成分的检测需求，针对罂粟小檗碱桥酶基因设计了TaqMan特异性引物和探针，并建立了食品及调味品样品前处理和DNA提取方法，建立了食品及调味品中罂粟成分TaqMan实时荧光PCR检测方法，方法检出限为0.01%，灵敏度为10 pg。与普通 PCR法和SYBR Green等荧光染料法相比，TaqMan探针法具有更好的特异性，检出限更低，结果判读直观无污染。方法的建立可作为食品及调味品中非法添加罂粟成分的检测鉴定方法，也可为其他与罂粟相关的方法研究提供借鉴和参考。

罂粟；食品；调味品；TaqMan 实时荧光PCR

近年来，多地传出火锅底料中加入罂粟壳的报道，国家卫计委及工商部虽已加强管理，但屡禁不止。仍有商家为了牟取利益，不惜违法乱纪，在调料中加入罂粟成分或是未经灭活的罂粟种子，给消费者的身体健康带来极大危害。罂粟壳为罂粟科植物罂粟的干燥成熟果壳，具有敛肺止咳、涩肠、止痛的功效，包含吗啡、可待因、罂粟碱等20多种生物碱。吸食罂粟壳及其制品，会使吸食者在心理、生理上成瘾，对人体的肝脏、心脏等器官产生毒害作用。因此，罂粟壳在我国被列入麻醉药品的范围予以管制，作为非食用物质，严格禁止在食品及调味品中添加使用。

目前罂粟成分的检测方法主要集中在对于罂粟来源生物碱成分的检测[1]，方法主要有薄层层析法、紫外分光光度法[2]、液相色谱法[3-5]、气相色谱-质谱法、酶联免疫法[6]。这些方法适用范围较广，但仅能对食物中罂粟壳残留的生物碱进行间接检测，不能对罂粟物种来源进行准确定性，不能充分满足对罂粟违禁成分的执法检验和整治监管的需要。

本试验建立了利用实时荧光定量PCR (real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测食品及调味品中罂粟成分的检测方法[7]，针对罂粟特有基因小檗碱桥酶基因(Papaversomniferumberberine bridge enzyme bbe1)设计特异性的引物和探针，提取调味品总DNA后，进行PCR扩增检测，其检出限和灵敏度分别达到0.01%和10 pg。同时，针对火锅底料高油脂含量的特点建立优化了DNA提取方法。本实验建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，相比于以往的普通PCR法和荧光染料法具有无污染，特异性更强，灵敏度更高，检出限更低的特点[8]。因此，该方法特别适用于各类调味品中非法添加罂粟成分的检测，为食品及调味品中罂粟成分快速、准确检测标准的制定提供依据，为相关产品的执法监管提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

桂皮、八角、香叶等7种调味品，海底捞清汤火锅底料、炖肉料、排骨鲜味王等8种复合调味品均购自上海世纪联华超市。鱼腥草、金银花、紫花地丁等36种药材均由安徽出入境检验检疫局技术中心提供，见表1。罂粟种子为实验室保存样品。

表1 用于罂粟特异性检测的样品列表

续 表

TianGen DP-305植物基因组DNA提取试剂盒、TianGen DP-326深加工食品DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司(TianGen Biotech (Beijing)Co., Ltd., Beijing, China)；引物和探针由辉瑞公司合成(Pfizer, Inc. NYSE：PFE,USA)；TaqMan Gene Expression Master Mix(货号：4369016)试剂均购自Applied Biosystems 公司(Applied Biosystems Inc., USA)。

试验相关仪器：有液氮冷冻研磨仪SPEX 6580 SPEX，USA；紫外分光光度计Nanovue Plus GE Healthcare，United Kingdom；实时荧光PCR仪ABI Viia7，实时荧光PCR仪ABI 7300 Applied Biosystems Inc.,USA；BP310S电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；5415R冷冻离心机 上海奥陆生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

1.2.1.1 固体样品

称取25 g样品，用液氮冷冻研磨仪研磨粉碎，称取200 mg样品至离心管中，按照1.2.2步骤提取DNA。

1.2.1.2 液体样品(火锅底料等油脂含量较多的样品)

称取250 g样品，倒入500 mL的分液滤斗中(可以准备2个分液滤斗)，静置1～2 h，样品会分为3层，上层是油脂，中间是水相，下层是固体残渣。

残渣处理：将残渣分离到100 mL烧杯中，取部分残渣到研钵或者研磨仪中，研磨粉碎，取1～2 mL至离心管中。

水相处理：残渣分离后向分液滤斗中加入100 mL石油醚，震荡5 min后静置，收集下层水相，采用大体积浓缩仪(40～60 ℃+抽真空+低速离心)浓缩至1～5 mL，取1 mL至离心管(2 mL)中。

残渣和浓缩后水相均采用1.2.2步骤继续提取罂粟DNA。

1.2.2 罂粟及香辛料、药材的DNA提取

采用TianGenDP-305植物基因组DNA提取试剂盒(TianGen DP305-02)提取桂皮、八角、香叶等7种香辛料和鱼腥草、金银花、紫花地丁等36种药材的DNA。采用TianGen DP-326植物基因组DNA提取试剂盒提取海底捞清汤火锅底料、炖肉料、排骨鲜味王等8种复合调味品中的DNA。提取的DNA采用紫外分光光度仪Nanovue Plus测定浓度和纯度，模板量控制在30 ng/反应以上。

1.2.3 引物设计和荧光PCR扩增

针对罂粟小檗碱桥酶bbe1基因设计特异性引物探针，引物及探针序列见表2[9，10]。实时荧光PCR反应体系见表3。

表2 引物及探针序列

表3 SYBR Green 实时荧光PCR反应体系

TaqMan实时荧光PCR反应程序为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，90 ℃ 10 s ，58 ℃ 1 min，58 ℃收集荧光，共45个循环。

1.2.4 方法特异性

选取常见的香辛调味料 7种，罂粟近缘植物虞美人，其他植物种类包括鱼腥草、金银花、紫花地丁等共36种，按照1.2.1的方法进行前处理后，实时荧光PCR扩增检测引物特异性。

1.2.5 方法灵敏度

将抽提得到的罂粟种子基因组DNA测定浓度，调整浓度为100 ng/μL，10倍梯度稀释成10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/L，10 pg/L，1 pg/L共6个浓度梯度，进行灵敏度试验。

1.2.6 方法检出限

将罂粟种子样品研磨粉碎后，按照重量比分别添加到不含罂粟成分的玉米淀粉基质中，制备成100%，10%，5%，2%，1%，0.1%，0.01%，0.001%共8个梯度含量的样品，进行检出限试验。

2 结果与讨论

2.1 引物特异性试验

将7种香辛调味料和36种常用药材与罂粟种子一起抽提DNA并纯化，抽提情况见表4，以罂粟种子DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照，利用表2选取的扩增体系对引物进行特异性试验。扩增结果见图1。可见引物和探针仅对罂粟种子DNA扩增阳性，有明显S型扩增曲线，对其余7种香辛调味料和36种常用药材扩增阴性，提示该引物和探针特异性好。

表4 7种香辛料和36种药材中DNA抽提情况

图1 实时荧光 PCR引物特异性试验扩增曲线图

2.2 实时荧光PCR灵敏度试验

取10 ng/μL，1 ng/μL，100 pg/L，10 pg/L，1 pg/L 5个梯度稀释的模板各1 μL进行PCR扩增，扩增Ct值见表5，扩增曲线见图2。可知随罂粟成分浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，在模板使用量为10 pg时，有明显S型扩增曲线，检出灵敏度达到10 pg。

表5 实时荧光PCR灵敏度试验Ct值

图2 实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图

2.3 实时荧光PCR检出限试验

抽提获得罂粟含量分别为100%，10%，5%，2%，1%，0.1%，0.01%，0.001%共8个梯度的系列稀释品，取每孔10 ng用于PCR扩增，扩增Ct值见表6，扩增曲线见图3。

表6 实时荧光PCR检出限试验Ct值

图3 实时荧光PCR检出限试验扩增曲线图

注：A:0.001%，B:100%，C:10%，D:5%，E:2%，F:1%，G:0.1%，H:0.01%。

由图3可知，随着罂粟成分浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，0.01%的模板有明显的S型扩增曲线，检出限达到0.01%。

2.4 实时荧光PCR方法在市场样品检测中的应用

在上海世纪联华超市购买的8种调味品样品，提取DNA后测定浓度并扩增18S rRNA，见表7。其中1种未提取到可供检测的DNA。随后以罂粟种子DNA为阳性对照，各取100 ng进行扩增试验，扩增曲线见图4。结果表明该批超市抽取样品中未检出阳性。

表7 8种调味料DNA抽提情况

图4 8种调味料实时荧光PCR扩增曲线图

3 结论

本试验建立了罂粟成分的实时荧光PCR 检测方法，针对罂粟物种特异基因设计引物和探针，仅需结合实时荧光扩增曲线图，2 h就能准确检测到调味料中罂粟这一非法添加物的存在，灵敏度达到10 pg，检出限达到0.01%。目前市面上用的香辛料原料或复配获得的复合调味品品种繁多，其中含有大量的芳香类、色素类、油脂类物质，成分复杂，本试验在样品前处理上针对固体样品(主要是粉状、块状)和液体样品(主要是油状、膏状、糊状、汁状)采取不同的前处理方法，以降低上述各类物质对DNA提取的干扰，提高检测的灵敏度。本试验在引物和探针的特异性试验中，除了选取常用的7种香辛料，还选取了与罂粟具有同源性的36种药材，表现了引物和探针的良好特异性。实时荧光PCR检测方法直接针对罂粟物种特异DNA，具有较高的检测灵敏度和准确度，操作简便，可作为复合调味品中非法添加罂粟成分鉴定的快速检测方法。同时，该方法在食品添加剂和调味品安全领域的检测把关上，具有较好的应用前景。

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Detection of Papaver somniferum in Food and Condiment by Real-time PCR

GAO Qin1, ZONG Kai2,YANG Jie-lin1*, PAN Liang-wen1

(1.Technical Center for Animal, Plant and Food Inspection and Quarantine, Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135,China；2.Technical Center of Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei 230022,China)

A method of real-time PCR is established for detectingPapaversomniferumingredient in food and condiment. The TaqMan specific primers and probes are designed forPapaversomniferumberberine bridge enzyme bbe1. The pre-processing and DNA extraction method is set up for detecting food and condiment samples. The limit of detection (LOD) ofPapaversomniferumingredient in food and condiment for this method is 0.01%. The absolute sensitivity ofPapaversomniferumgenomic DNA detection is 10 pg. Compared with the conventional PCR and SYBR Greenfluorescent dye PCR such as SYBR Green, TaqMan probe method has better sensitivity and specificity, visible results and without pollution. This method could be applied for detectingPapaversomniferumin food and condiment. Meanwhile, it can provide references for otherPapaversomniferumdetection methods.

Papaversomniferum;food;condiment; TaqMan real-time PCR

2016-06-11 *通讯作者

高琴(1983-)，女，上海人，工程师，研究方向：食品及农产品检测。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.026

1000-9973(2016)12-0113-05