鹿产气荚膜梭菌二价灭活疫苗的制备和免疫效力试验

李自青,赵立峰,刘　宏

(1.山西大同大学医学院,山西大同037009;2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所,山西大同037009;3.天津市北辰区养殖业发展服务中心,天津北辰300400)

鹿产气荚膜梭菌二价灭活疫苗的制备和免疫效力试验

李自青1,2,赵立峰3,刘宏1,2

(1.山西大同大学医学院,山西大同037009;2.山西大同大学呼吸病与职业病研究所,山西大同037009;3.天津市北辰区养殖业发展服务中心,天津北辰300400)

为了研制鹿产气荚膜梭菌A型和C型二价灭活疫苗,对疫苗的免疫效力和免疫持续期以及疫苗保存期进行测定,从而为开发免疫原性较好的无毒副作用的灭活疫苗奠定基础.将产气荚膜梭菌T5-A和J28-C株的培养液按1∶1混和,混合菌液按9∶1加入灭菌铝胶,经浓缩制备3批灭活疫苗0406-1,0406-2,0406-3.安全检验合格后,采用"血清中和试验"检验技术,进行家兔攻毒与血清抗体效价的平行试验,测定疫苗的免疫效力和免疫持续期以及疫苗保存期.结果是疫苗的安全性良好,免疫效力表明疫苗的免疫保护率为100%,抗体效价显示C型抗体效价高于A型,疫苗对C型菌的保护期长达6个月,而对A型菌的保护期为3个月.疫苗保存期的测定表明,疫苗可以保存10个月以上.表明3批疫苗安全性较好,对家兔有较强的免疫保护,为疫苗的下一步鹿田间试验提供了理论依据.

产气荚膜梭菌;鹿灭活疫苗;疫苗制备;免疫效力

产气荚膜梭菌是一种严重威胁人类和动物健康的病原菌.该菌在土壤、人以及动物肠道和粪便中广泛存在,经常由于深部创伤继发感染,可引起人食物中毒和动物出血性肠炎[1].出血性肠炎是我国饲养鹿最常见的疾病,其死亡率占饲养鹿总死亡率的60%以上,给鹿养殖场造成很大的威胁[2].本试验对产气荚膜梭菌灭活疫苗进行研制,并对疫苗的免疫效力和免疫持续期以及疫苗保存期进行了测定.旨在为开发免疫原性好且没有毒副作用的二价鹿产气荚膜梭菌灭活疫苗,为防止鹿产气荚膜梭菌病的流行奠定基础.

1　材料与方法

1.1菌株和实验动物疫苗制备菌种产气荚膜梭菌T5-A和J28-C由本校微生物实验室保存.健康家兔体重1.5～2 kg,ICR品系小鼠体重10～ 12 g,雌雄各半,由本校实验动物中心提供.

1.2细菌培养和毒力测定产气荚膜梭菌T5-A和J28-C菌株参照文献[3]测定的最佳产毒条件在35℃培养7 h,取培养物(4℃)下4 000 r/min离心20 min,收集上清倍比稀释后,每个剂量耳静脉注射6只家兔,观察家兔死亡情况,确定T5-A和J28-C菌株对家兔的最小致死量(MLD).同样的方法测定菌株对小鼠的最小致死量(MLD).

1.3全菌灭活疫苗的制备将菌体培养液离心过滤除菌后,上清液用无菌1 mol/L NaOH调至pH值7.2,按体积比加入0.5%甲醛,37℃下脱毒5 d.经灭活检验合格后,将产气荚膜梭菌T5-A和J28-C株的培养液按1∶1混和.混合菌液按9∶1加入灭菌铝胶,混匀,4℃下静置10 d.弃1/2上清液,加入剩余量0.006%硫柳汞,混匀.无菌检验合格后,配苗分装,制备3批产气荚膜梭菌灭活疫苗0406-1,0406-2,0406-3,4℃保存.

1.4疫苗安全检验按照《中国兽药典》(2010版)[4]质量检验方法对每种疫苗进行物理性状和细菌性检验,合格后用3批疫苗分别接种体重1.5～2 kg健康家兔6只,每只颈部皮下注射4 mL,连续10 d观察家兔局部或全身有无异常反应. 1.5免疫剂量测定取健康家兔60只,随机分成3组,每组20只,疫苗0406-1采用颈部皮下注射,注射剂量分别为1 mL、2 mL、3 mL,同时取10只作为对照注射生理盐水.免疫21 d后,每组20只平均分为两个小组,分别用1MLD A型和C型产气荚膜梭菌毒素耳静脉注射进行攻毒,观察7 d,根据家兔死亡情况确定最小免疫剂量,并计算保护率.

1.6免疫效力试验3批疫苗以最小免疫剂量分别接种健康家兔20只,21 d后耳静脉采血,将每组免疫家兔血清混合,取0.1 mL混合血清分别加入不同最小致死量(MLD)的A型菌和C型菌,混匀,37℃恒温水浴40 min,然后尾静脉注射小鼠,每组6只,每只0.3 mL,同时设立对照,根据小鼠死亡情况测定血清抗体效价.然后分别用1MLD A型和C型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒,计算保护率.

1.7免疫持续期试验分别用3批疫苗免疫健康家兔,在免疫3个月、6个月及9个月后耳静脉采血,测定血清抗体效价,方法同1.6.之后分别用1MLD A型和C型产气荚膜梭菌毒素进行攻毒,观察家兔死亡情况并计算保护率. 1.8疫苗保存期试验3批疫苗在4℃～10℃保存8、10、12个月后,分别取出免疫家兔,免疫21 d后,分别用A型和C型产气荚膜梭菌毒素进行攻毒,攻毒剂量为1MLD,观察家兔死亡情况.

2　结果

2.1试验菌株毒力测定毒力测定结果显示,产气荚膜梭菌对家兔的MLD:T5-A为1.5 mL,J28-C为0.025 mL.对小鼠的MLD:T5-A为0.025 mL,J28-C为0.001 mL.

2.2安全性检验制备的疫苗物理性状呈均匀的混悬液,无菌检验呈阴性.3批疫苗接种的家兔食欲正常,精神状态良好,体温未升高,无全身不良反应,注射部位无溃烂,仅个别家兔局部出现轻微的肉芽肿,表明疫苗无毒,安全性较好.

2.3最小免疫量试验不同剂量疫苗免疫家兔后的攻毒结果显示,免疫剂量1 mL(8X1010CFU)时疫苗保护率为60%～70%(6/10～7/10),免疫剂量为2 mL和3 mL的保护率均达到100%(10/10),说明疫苗的最小免疫剂量为2 mL.

2.4免疫效力试验和C型产气荚膜梭菌毒素对免疫组家兔和对照组进行攻毒,结果表明,疫苗的免疫保护率均为100%(10/10).血清抗体效价结果显示,A型毒素1MLD～3MLD剂量测毒时,小鼠存活,4MLD～6MLD剂量时,小鼠死亡;C型毒素1MLD～4MLD剂量时,小鼠存活,5MLD～ 6MLD剂量时,小鼠死亡;阳性对照小鼠全部存活,阴性对照小鼠死亡.表明C型抗体效价为4MLD,A型抗体效价为3MLD,提示我们疫苗对C型菌的免疫保护可能高于A型.

2.5免疫持续期试验3批疫苗(0406-1,0406-2,0406-3)免疫家兔后,攻毒结果显示,3个月后疫苗对A型菌和C型菌的保护率都为100%(10/ 10),6个月后对A型菌的保护率降低到60%～ 70%(6/10～7/10),而对C型菌的保护率仍为100%(10/10),9个月后对A型菌保护率降低到20%～30%(2/10～3/10),对C型菌保护率为60%～70%(6/10～7/10).血清抗体效价测定结果显示,免疫3个月后与初免疫后抗体效价保持不变,A型为3MLD,C型为4MLD;免疫后6个月抗体效价下降,A型为1MLD,C型为2MLD;免疫后9个月A型为0,C型为1MLD.表明疫苗的保护效率与血清抗体效价保持一致.2.6疫苗保存期试验疫苗在4℃～10℃保存8个月、10个月疫苗对A型菌和C型菌的保护率均为100%(10/10),但保存12个月后疫苗对A型菌的保护率降低到30%～50%(3/10～5/10),对C型菌的保护率降低到50%～70%(5/10～7/10).

3　讨论

产气荚膜梭菌病对家畜养殖业的危害非常严重,其中鹿出血性肠炎就是危害鹿养殖业最为严重的疾病之一,在20世纪90年代曾经给山西的鹿养殖户造成了巨大的经济损失.该病一旦发病,病死率极高,疫苗防控是最有效的办法.疫苗的有效防控程度取决于制备疫苗的菌株与发病流行的菌株抗原的亲缘关系[5].本研究在采集山西省内各养鹿场因出血性肠炎而病死鹿病料,分离并鉴定其病原菌是A型和C型产气荚膜梭菌的基础上,制备了产气荚膜梭菌A型菌和C型的二价灭活疫苗,以铝胶为佐剂,通过安全性和免疫效力检验,表明疫苗的安全性良好,对A型菌和C型菌的保护率均达到100%,对A型菌的保护期是3个月而对C型菌的保护期可长达6个月,疫苗可以保存10个月以上;表明疫苗符合《兽药典》规定的质量标准.铝胶虽然作为免疫佐剂被广泛应用,但抗原免疫原性弱时,不能够很好的提高免疫原性,而且不能介导细胞免疫反应[6].所以下一步将筛选更适宜的佐剂,进一步提高疫苗的免疫原性.

灭活疫苗的效力检验以往一直采用本动物攻毒法,这种方法成本高,周期长,而且程序复杂[7].本试验采用"血清中和试验"的检验技术,进行了家兔攻毒与血清抗体效价的平行试验.血清抗体效价测定中C型抗体效价高于A型抗体,免疫攻毒时,疫苗对C型菌的保护优于A型菌.说明用"血清中和试验"来代替"本动物攻毒"的效力检验技术可行.这种技术的应用不仅可以节省成本、缩短周期,而且操作方便,尤其适用于对多价疫苗的检验,从而为今后的疫苗检验奠定基础.

[1]Qiu H,Chen F,Leng X,et al.Toxinotyping of Clostridium per⁃fringens fecal isolates of reintroduced Père David's deer(Elaphur⁃us davidianus)in China[J].J Wildl Dis,2014,50(4):942-945.

[2]钟震宇,张林源,唐宝田.2000-2009年北京南海子麋鹿出血性肠炎发生特点分析[J].畜牧与兽医,2013,45(4):56-58.

[3]赵立峰,郭宏伟,任家琰,等.A型产气荚膜杆菌产毒条件的测定[J].经济动物学报,2005,9(2):100-102.

[4]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[S].三部.2010年版.

[5]Belikov S I,Kondratov I G,Potapova U V,et al.The relation⁃ship between the structure of the tick-borne encephalitis vi⁃rus strains and their pathogenic properties[J].PLoS One,2014,9 (4):e94946.

[6]Mody K T,Popat A,Mahony D,et al.Mesoporous silica nanopar⁃ticles as antigen carriers and adjuvants for vaccine delivery[J].Na⁃noscale,2013,5(12):5167-5179.

[7]曲海波,刘洪斌,白同臣,等.A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与全菌灭活疫苗的安全性和免疫效力的比较研究[J].中国兽药杂志,2010,44(2):15-16.

Preparation and immunity test of two bivalent inactivated vaccineof Clostridium perfringens from deer

LI Zi-qing1,2,ZHAO Li-feng3,LIU Hong1,2
(1.Medical College of Shanxi Datong University,Datong 037009,China; 2.Respiratory and Occupational Disease Research Institute of Shanxi Datong University,Datong 037009,China; 3.The service center for development of aquaculture industry in beechen district in tianjin,Tianjin 300400,China)

To develop a bivalent inactivated vaccine of Clostridium perfringens type A and C from deer,we measured the vac⁃cine immune efficacy and duration and vaccine storage period.Culture solution of Clostridium perfringens T5-A and J28-C was mixed with 1∶1,and then mixed the bacteria liquid with the disinfectant gel at a ratio of 9∶1.And three batches of inactivated vac⁃cine 0406-1/0406-2/0406-3 were prepared.After safety inspection"serum neutralization test,vaccine immune efficacy and dura⁃tion period and vaccine storage period were tested.Vaccine was good safety,and protection rate for Clostridium perfringens type A and C was 100%.The antibody titer of type C was higher than type A,and the vaccine protection for type C strains was up to 6 months,and type A was 3 months.The vaccine could be kept for more than 10 months.The three batches of vaccine have good safe⁃ty,and a strong immune protection to the rabbits.

Clostridium perfringens;Inactivated vaccine of deer;Preparation;immunity test

LIU Hong

S852.4

A

0529-6005(2016)06-0025-03

2015-09-10

大同市科技攻关计划项目(201361)

李自青(1980-),女,讲师,硕士,主要从事分子生物学与肿瘤免疫学研究,E-mail:liziqing_1234@163.com

刘宏,E-mail:a-liuhong@163.com