我国鹅细小病毒研究进展

2016-02-02杜翔宇李温明胡振林张甜甜胡桂学

中国兽医杂志 2016年6期

关键词：小鹅细小抗体

杜翔宇,李温明,胡振林,张甜甜,胡桂学,董　浩

(1.吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;2.铁岭出入境检验检疫局,辽宁铁岭112616;3.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118)

我国鹅细小病毒研究进展

杜翔宇1,李温明2,胡振林1,张甜甜1,胡桂学3,董浩1

(1.吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;2.铁岭出入境检验检疫局,辽宁铁岭112616;3.吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118)

1　小鹅瘟的流行病学

鹅细小病毒(GPV)属于单股DNA病毒,在分类学上属于细小病毒科,细小病毒亚科,细小病毒属的成员.小鹅瘟是由鹅细小病毒引起的一种传播快、死亡率高、高度接触性急性或亚急性败血性传染病,大多发生在1个月龄以内的雏鹅,2～3日龄的雏鹅即开始发病,7日龄以内的雏鹅最易感染.该病具有较强的传染性和较高的死亡率,随着近年来对小鹅瘟病毒流行病学的研究发现,小鹅瘟易感鹅群的发病日龄有逐渐增大的趋势,而且呈现无规律散发性流行.黄宇翔等采用临床调查、血清学和病原学检测技术进行了鹅细小病毒病、鹅副黏病毒病流行病学调查,结果表明,鹅细小病毒流行季节为4～8月份,发病率为60%～70%;鹅副黏病毒病流行季节为5～7月份,发病率10%～20%.二者共同点是对雏鹅有高度的致病性,尤其10日龄以内雏鹅感染后,发病率和死亡率在90%以上,甚至可达100%[1].

2　GPV的分子生物学特征

2.1GPV的基因组特征GPV为DNA病毒,分为正链DNA和负链DNA,基因组全长约为5.2 kb(分子质量约为6X106Da).GPV基因组的一大特点是正链与负链DNA分子均含有回文结构的序列,小鹅瘟病毒的两种DNA链在核酸提取很容易出现退火现象,二者结合变成互补的双链DNA.病毒的整个基因组分为编码区和非编码区,非编码区位于编码区两侧,形成回文序列;编码区处于中间位置,包含两个开放阅读框,分别包括左侧LORF和右侧RORF,有一个长短为18个碱基的片段将两者隔开,LORF编码NS1、NS2非结构蛋白,RORF编码VP1、VP2、VP3结构蛋白,VP2和VP3蛋白是小鹅瘟的主要保护性抗原,可以诱发机体产生抗体,发生免疫反应.所有的编码基因彼此重叠,结构基因和非结构基因都有独立的启动子区域,具有共同的羧基末端,形成套式的结构. VP基因是GPV的重要基因,关系到病毒毒粒的衣壳蛋白,同时也作为抗原能够诱导机体产生抗体,同时VP蛋白也关系到病毒的毒力和致病性.

目前仅有7个GPV毒株已知全基因序列,更多GPV毒株的全基因序列测定将有助于理解GPV的遗传、演化、病毒嗜性、宿主域和致病性等相关信息.王浩等应用PCR方法获得GPVY株和E株的全基因组核苷酸序列,通过分析VP区糖基化位点的差异发现Y株和E株均缺失703-705 NRT糖基化位点,推测结构蛋白糖基化位点的改变有可能影响病毒的毒力,甚至使病毒形成免疫逃逸[2].张云等采用PCR技术扩增了鹅和番鸭全长细小病毒基因,序列分析表明,鹅和番鸭细小病毒NS之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.9%～82.9%和89.5%～91.2%,鹅和番鸭细小病毒VP1之间的同源性分别为79.7%～88.7%和85.5%～93.3%[3].王志强等对鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析,强毒株基因核苷酸序列变化低于弱毒株,这说明目前流行GPV强毒株的基因序列保守性高于弱毒株[4].

2.2结构蛋白GPV能够编码3种结构蛋白,分别为VP1、VP2蛋白和VP3蛋白.小鹅瘟病毒的结构蛋白VP的主要功能是刺激机体产生抗体,同时该结构也与病毒的毒力和致病性有密切关系.马波对鹅细小病毒VP1基因的原核表达及抗原性分析,结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性[5].胡晓静等对2株鹅细小病毒的主要结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析,VP2的核苷酸序列全长分别为2 044 bp和2 050 bp,与番鸭细小病毒的同源性为76.8%～80.0%,为细小病毒载体的构建和基因工程疫苗的设计奠定基础[6].

VP3蛋白在3种核衣壳蛋白中是含量最多,且在GPV或MDPV感染的水禽体内能诱导中和抗体的产生,VP3是检测GPV或MDPV抗体最合适的候选蛋白.李永峰建立了检测雏番鸭水禽细小病毒抗体的间接ELISA方法,为水禽细小病毒感染的诊断、免疫后抗体和母源抗体水平检测以及基因工程疫苗的研究提供了一种简便、灵敏诊断方法[7].张雅为对实验免疫的鹅血清抗体进行检测,结果表明,非结构蛋白NS2的抗体最高峰较结构蛋白VP3的早出现一周,选择了GPV非结构蛋白NS2作为检测抗原,为使用重组结构蛋白亚单位疫苗免疫动物时鉴别自然感染与疫苗免疫奠定了基础[8].

2.3非结构蛋白目前关于GPV非结构蛋白(nonstructural protein,NS)的报道不是很多,远不如结构蛋白研究的丰富和深入.GPV的非结构蛋白为LORF编码的NS1和NS2,NS蛋白在GPV复制的早期产生,GPV NS蛋白的主要功能是负责病毒DNA的复制以及对基因表达的调控.NS2蛋白和NS1蛋白共同作用于细胞,产生对细胞有害的毒性,它的主要作用是协同、帮助NS1蛋白对细胞的毒性作用.孙敏华等克隆了鹅细小病毒佛山株的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a-NS1,分析表明NS1蛋白得到了表达,并且能与抗GPV的番鸭血清发生特异性反应[9].邢明伟将NS2基因亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,并将质粒转化于感受态菌BL21(DE 3)plyS中,经IPTG诱导获得重组NS2蛋白,发现其可以与GPV阳性血清发生特异性反应[10].

3　细小病毒细胞受体研究进展

病毒感染细胞的第一步就是吸附,病毒能与细胞吸附的关键就是要和细胞受体结合.研究病毒的细胞受体可以揭示病毒与宿主细胞之间的关系,了解病毒对各种宿主细胞嗜性,进入细胞的途径机制以及对宿主敏感细胞的具体影响,还对了解病毒进入细胞后的复制动力学以及其他一些细胞内事件,病毒的增殖与免疫机制相互的关系和作用提供一定参考[11-12].

李凌云等利用酵母双杂交技术分别构建了"猎物(prey)"蛋白表达载体和麻疹病毒VAP"诱饵(bait)"蛋白表达载体,然后共同转化进入酵母菌细胞,利用已经建立好的敏感细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个受体蛋白.董浩采用酵母双杂交技术从鸭胚成纤维细胞的cDNA表达文库中,筛选出GPV细胞结合蛋白,为阐明小鹅瘟致病、传播和定植规律的研究奠定基础,筛选到三个与VP1互作的蛋白,分别为核糖体蛋白S12,翻译延伸因子EEF1A1以及一种未知蛋白,证实了鸭胚成纤维细胞的核糖体蛋白S12能够与鹅细小病毒VP1蛋白相结合,为后续寻找能够与核糖体蛋白互作的其他蛋白奠定基础.在此研究基础之上,郭慧通过蛋白体外相互作用的GST Pull-Down技术,验证S12蛋白与小鹅瘟病毒结构蛋白VP1的相互作用,结合产物经SDS-PAGE凝胶分析,结果证明S12与VP1能够在体外进行结合,鸭胚成纤维细胞核糖体蛋白S12对GPV的增殖存在一定的抑制作用[13].

4　病毒的检测方法

临床上可根据病鹅的临床症状和病理变化作出初步诊断,随着科学技术的发展,小鹅瘟分子生物学诊断技术取得了很大的进展,由原来传统的检测技术受到发展为免疫学技术和高新分子生物学技术的方向快速发展,为当前更有效防制GPV和对GPV进一步研究提供最新的技术保障.朱小丽将抗番鸭GPV单抗腹水采用透析法标记异硫氰酸荧光素,制备成抗GPV荧光抗体,与间接荧光方法的符合率为92.9%,表明GPV荧光抗体具有较好的特异性、敏感性和准确性,可用于临床快速诊断番鸭小鹅瘟病[14].刘飞成功地制作成了双抗夹心法GPV胶体金免疫层析试纸条,在10～15 min内可得到检测结果,敏感度为104.1GELD50/0.2 mL,该试纸条特异性高,重复性好,可用于GPV的临床快速诊断[15].

荆志强组装胶体金免疫层析试纸条,并利用Point-of-care testing(POCT)scanner进行定量研究,制得的试纸条与琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验相比,符合率分别为100%、97.7%,表明胶体金免疫层析技术正是一种简易、快速的免疫学检测技术[16].饶桂波建立了PCR-DHPLC检测方法是一种新的检测GPV的方法,阳性检出率达100%,是常规PCR方法的100倍,监测和防制工作上升到新的水平[17].傅秋玲等建立了一种快速检测鹅细小病毒的LAMP方法,且其检测灵敏度达150 pg/μL,可见该方法为适合基层及现场快速检测、实用灵敏的分子生物学方法[18].

5　鹅细小病毒免疫学研究

目前关于鹅细小病毒的免疫学方面的研究热点主要包括活疫苗、灭活疫苗及基因工程疫苗的研制、单克隆抗体的研制与开发和抗原表位的研究等几个方面.王倩用筛选出4株分泌抗GPV抗体的阳性杂交瘤细胞株,其中1G3和3B11杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗GPV单克隆抗体的能力,并对免疫后的抗体水平进行监测,为鹅细小病毒病的疫情监测和免疫抗体效价测定奠定基础[19].卢菲等鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较,结果显示,小鹅瘟VP3基因疫苗免疫小鼠的外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应,诱导的CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫功能和血清IgG抗体水平在不同时间段都显著或极显著高于弱毒疫苗免疫组[20].郭鹭利用Ni-NTA亲和层析纯化后的GPV VP3重组蛋白作为免疫原,通过Western Blot定位出两个抗原表位为430～435 aa和643～647 aa[21].王娟对抗GPV单克隆抗体的抗原表位分析,结果显示,在VP3基因的135～332 aa和322～535 aa处用间接免疫荧光检测,并初步确定3E8株单抗的抗原表位在322～332 aa上[22].

6　展望

蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或非生物胁迫的分子机制重要途径,深入研究小鹅瘟病毒的复制机理、揭示病毒结构蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用,从蛋白质水平阐明病毒侵染的过程,将会成为我们未来研究工作的重点;同时为了加强该病的流行监测,进一步完善和建立及时、准确、快速的检测方法,是该病临床诊断、防疫与检疫的迫切要求,将有助于降低该病在家禽的流行;鹅细小病毒免疫学是研究鹅细小病毒工作的重要组成部分,研制基因工程活载体疫苗和DNA疫苗等新型疫苗也势在必行;我国小鹅瘟研究工作虽然取得了一定的成果,但是目前的小鹅瘟防控仍旧存在问题,一些科学研究成果还没得到应用和推广,需要研究工作者在小鹅瘟病毒方面的研究付出更多的努力.

[1]黄宇翔,刘力威,李洪彬,等.鹅细小病毒病、副黏病毒病的流行病学调查及病原分离鉴定[J].中国家禽,2013,35(2): 22-29.

[2]王浩,田先举,张烁,等.2株鹅细小病毒全基因组特征分析[J].畜牧兽医学报,2013,44(40):602-609.

[3]张云.鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[J].中国预防兽医报,2008,30(6):415-419.

[4]王志强.鹅细小病毒VP1_VP3非重叠区基因的克隆与序列分析[J].中国家禽,2011,33(19):28-30.

[5]马波.鹅细小病毒VP1基因的克隆序列分析及表达载体的构建[J].中国兽医科学,2010,40(2):135-138.

[6]胡晓静.2株鹅细小病毒的主要结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析[J].现代农业科技,2008,23:261-264.

[7]李永峰.鹅和番鸭细小病毒VP3-ELISA诊断方法的建立[D].北京:中国农业科学院,2010.

[8]张雅为.鹅细小病毒VP3-ELISA和NS2-ELISA检测方法的建立及抗体消长规律的测定[D].哈尔滨:东北农业大学,2008.

[9]孙敏华,董嘉文,李林林,等.鹅细小病毒VP3基因的克隆及表达[J].广东畜牧兽医科技,2013,38(5):25-28.

[10]邢明伟.鹅细小病毒NS2基因的原核表达及抗原性检测[J].中国预防兽医学报,2010,32(2):148-150.

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[13]郭慧.GPV VP1蛋白与DEF核糖体蛋白S12的互作验证及其对GPV增殖的影响[D].长春:吉林农业大学,2014.

[14]朱小丽.应用胶乳凝集技术诊断番鸭小鹅瘟病[J].中国预防兽医学报,2012,34(9):715-718.

[15]刘飞.抗小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析试纸条的研制[D].南京:南京农业大学,2011.

[16]荆志强.鹅细小病毒抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[D].哈尔滨:东北农业大学,2010.

[17]饶桂波.鹅细小病毒的分离鉴定及PCR-DHPLC检测方法的建立与初步应用[D].长春:吉林农业大学,2013,28-37.

[18]傅秋玲,施少华,万春和,等.检测鹅细小病毒环介导等温扩增方法的建立及结果判定方法改进[J].福建农业学报,2013,28(1):9-13.

[19]王倩.鹅细小病毒NS基因PCR和单抗竞争ELISA检测方法的建立及应用[D].哈尔滨:东北农业大学,2011.

[20]卢菲.鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较[J].中国兽医科学2008,38(07):576-581.

[21]郭鹭.抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位的定位[J].中国动物传染病学报,2013,21(4):1-6.

[22]王娟.鹅细小病毒VP3基因的原核表达及其单克隆抗体的研制[D].扬州:扬州大学,2012.

S852.65+9.2

0529-6005(2016)06-0063-03