布鲁菌分型方法研究进展

刘　帅,马晓菁,钟　旗,叶　锋,吐尔洪.努尔,谷文喜,易新萍

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐830052;2.新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐830000)

布鲁菌分型方法研究进展

刘帅1,2,马晓菁2,钟旗2,叶锋2,吐尔洪.努尔2,谷文喜2,易新萍2

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐830052;2.新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐830000)

布鲁菌病是一种呈世界性流行并严重影响畜牧业发展和人类公共卫生安全的人兽共患病.布鲁菌属细菌是布鲁菌病的病原菌.目前已发现的布鲁菌有10个种23个亚型.建立快速、可靠的布鲁菌分型技术对于布鲁菌病的追根溯源、判断毒力、免疫力、遗传变异、流行病学特征及其防控具有重大意义.目前用于布鲁菌属细菌分型的方法主要分为生物分型和分子分型两类.传统的生物分型方法操作繁琐,周期长,使用活菌试验,生物安全风险较大[1].另外,由于菌株遗传变异等原因,出现了大量的非典型菌株,仅靠传统的分型方法已不能完全满足布鲁菌分型工作的需要.结合分子生物学技术快速、精确、安全等特点,多种分子分型方法被应用于布鲁菌的快速鉴定和溯源分析,其灵敏度、特异性、分辨力、重复性等都优于传统方法[2].本文就布鲁菌分型方法的应用研究进展予以综述.

1　生物分型

1.1生物学分型生物学分型主要根据布鲁菌的生化特性,如细菌生长时对CO2需要、H2S产生量、尿素酶活性、过氧化氢酶的量、阿尼林染料的敏感性、糖发酵试验和细胞代谢酶类(赖氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、葡萄糖等)活性的检测进行综合判定,这种传统的生物学分型法可以鉴定到种水平,也可以应用于布鲁菌的部分亚型的分型,在布鲁菌病的防治工作中发挥了积极而重要的作用.

1.2噬菌体和细菌素分型应用一系列噬菌体和细菌素对待检细菌进行裂解试验来进行分型.1986年,FAO/WHO布鲁菌病专家委员会将4种噬菌体Tb、Wb、Bk2、Fi作为布鲁菌种的常规鉴定方法,基本上可以鉴别S型布鲁菌.崔庆禄等研究表明,噬菌体SA对布鲁菌猪1、3型,牛1、3、6型,沙林鼠种敏感,同时A2、NM-R、NMg-1、NMg-2、NMy-1、NMy-2噬菌体对布鲁菌的分型鉴定有一定的参考意义[3-4].

1.3血清分型布鲁菌含有A、M、R 3种抗原,这3种抗原在不同的布鲁菌中含量不同.A抗原为牛种1型布鲁菌的主要抗原,M抗原为羊种1型布鲁菌的主要抗原,用A、M、R因子血清进行凝集试验对布鲁菌分型有一定意义[5].

1.4菌体组分分型细菌的细胞结构中普遍含有菌体组分(脂肪酸、脂多糖),不同种属的细菌,其组分的组成种类和含量表现出不同程度的差异,根据这种差异对菌株进行分型.国内外研究者应用气-液相色谱对布鲁菌脂肪酸成分进行了研究,可以区分布鲁菌的种和部分亚型[6-7].More⁃no等应用核磁共振技术测定布鲁菌脂多糖的结构,对布鲁菌进行分型.应用元素分析和热力学等技术测定布鲁菌脂多糖也可对布鲁菌进行分型[8-9].虽然脂肪酸和脂多糖分型不能完全区分出布鲁菌生物亚型,但是菌株的组成成分可以从另一个侧面反映出布鲁菌的种属进化关系,为布鲁菌的分型工作提供了更多的参考途径.

2　分子分型

2.1核酸探针目前应用于布鲁菌的主要是以16S核糖体基因(16S rRNA)与探针杂交,分析杂交图谱,对布鲁菌进行分型鉴定.Fernandez等选用3种荧光探针对所有布鲁菌属和种进行杂交检测,结果显示,用B9探针可将猪种布鲁菌2、3、4、5型和几乎全部布鲁菌菌属区别开[10].骆利敏采用核酸探针技术将我国99株布鲁菌分属17个RT型,表明我国布鲁菌在流行上具有复杂性[11].总体上看,核酸探针指纹图谱与传统分型有一定差异,可以作为传统分型方法的一种补充.但与其他分子分型方法相比,核酸探针操作较为复杂,对技术要求高,费用高,不适合在布鲁菌常规检测、鉴定分型中广泛应用.

2.2脉冲场凝胶电泳(PFGE)脉冲场凝胶电泳是一种分离大分子DNA的方法.利用内切酶对细菌染色体DNA消化,在脉冲场凝胶电泳中,由于电场在不断的在两种方向变动,使不同大小的DNA片段分开,进一步比对分析,从而对菌株分型鉴定.因其重复性好,分辨率高,已成为许多细菌分型鉴定、调查遗传关系的有效方法之一.骆利敏等将76株中国分离株分为39种PFGE类型,聚为四大类,同时聚类分析图表明牛羊猪绵羊附睾是由共同祖先进化而来,犬种是猪种菌的主要株或刚从猪种进化而来[12].崔步云对122株国内分离菌株进行PFGE检测,建立了PulseNet China网络数据库[13].该方法分辨效果好,还可以将待测菌株与数据库中菌株比较分析,但费时,成本高,且对操作人员有一定的技术要求.

2.3PCR及其衍生技术聚合酶链式反应(PCR)是一种体外DNA扩增技术,该方法有较强的特异性和较高的敏感性,在生物学领域广泛应用.国内外研究者建立了在属的水平上鉴定布鲁菌的普通PCR方法[14-16].2003年Bricke等建立了AMOS-PCR方法,该方法可同时鉴定布鲁菌六个种,有很强的应用价值,但鉴定到型存在一定困难[17].

实时荧光定量PCR是在一个反应体系内将靶基因的扩增与探针杂交检测相结合的PCR方法.Redkar等[18]用该方法可对牛种布鲁菌的7个型,羊种布鲁菌的3个型以及猪种布鲁菌1型进行鉴定.该方法具有较好的特异性和灵敏度,灵敏度可达到0.25 pg.Willian等在Redkar研究的基础上建立了一种实时多重PCR,可同时快速鉴定布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌[19].该方法比常规PCR敏感,操作简便、快速并可以降低DNA样品污染的风险,是一种特异、敏感、高效、快速、安全的布鲁菌鉴定分型方法.

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)是一种非常有用的通过用限制性内切酶对DNA选择性降解、进一步分析PCR产物的工具.Cloeckaert等用该方法可鉴定出布鲁菌的各种和型,但不能区分犬种和猪种布鲁菌3、4型[20].崔步云等应用PCR-RFLP法将107株国内外布鲁菌的参考菌株和地方流行菌株分为8个组[21],可用于典型和非典型布鲁菌的鉴定和分型而弥补传统分类方法的不足.扩增片段长度多态性分型(AFLP-PCR)法是将细菌基因组酶切后进行标记和扩增,从而获得DNA指纹图并进行分析.骆利敏等构建出我国布鲁菌株基因组扩增片段长度多态性DNA指纹图谱,从聚类分析树状图可以在种的水平上区分布鲁菌各株,甚至在种内细分为各亚型,但是对犬种和羊种布鲁菌的分型有一定程度的重叠[22].

2.4多位点序列(MLST)多位点序列分型(MLST)是一种通过对多个管家基因的测序,用核苷酸序列变异来发现细菌型别差异的分型方法.Whatmore等对160株布鲁菌进行MLST分析,共发现了27个序列型(ST).种系发生树显示各ST形成的类群与传统分类基本一致.46株海洋哺乳动物分离株分成5个ST,并可形成一个独立种[23].周晓艳等对分离自我国的47株羊种3型布鲁菌进行MLST分析,结果显示,19株布鲁菌的omp25基因与目前已有的等位基因型不同,被定义为1个新的等位基因型,即ST28.其余28株与已知的ST8型的各等位基因型一致[24].MLST具有较高的分辨率,但是需要测序,提高了成本,另外对于发生微小变异的菌株无法较好地区分.该方法可用于分子流行病学研究,适合于数据库储存和软件分析的基因分型方法.

2.5多位点可变数量串连重复序列(MLVA)多位点可变数量串联重复序列分型(MLVA)是利用细菌在进化过程中由于错配和重组而不断产生的可变数目串联重复序列(VNTR),基于在同源重复序列上出现差异数目而设计的一种细菌分型方法.Bricker等利用布鲁菌基因序列中的8个位点(MLVA-8)对美国的105株布鲁菌(包括标准株和分离株)进行分型,较好地区分各生物型[25].在此基础上Philippe等建立了布鲁菌MLVA-15分型方法并对236株布鲁菌进行了试验.结果显示,能准确鉴定一些传统方法难以鉴定的布鲁菌[26]. 2008年,Mireille等对该方法进一步完善并利用MLVA-16对527株布鲁菌(包括标准株和分离株)进行分型,获得了384个基因型,由此建立了布鲁菌2007数据库供各不同实验室进行比对分析[27],结果表明,该分型方法与传统方法有较高的一致性.MLVA分型方法不仅可用于阐明布鲁菌病的流行病学特征,也可用于传染源的追溯,而且标准化的MLVA方法还可用于国际间菌株的比较分析,对确定分离株的亲缘关系及遗传进化变异研究具有重要作用.

3　结束语

布鲁菌分型的目的是反映细菌在进化过程中较为重要的有意义的突变,寻找细菌衍化的内在规律,为疾病的预防与控制提供依据.目前还没有一种分型方法能完全反映布鲁菌的进化关系和分类地位,同时在临床和流行病学上又具有现实意义.相对于传统的布鲁菌生物分型方法,分子分型方法有极大的飞跃.该类方法不仅具有快速、准确、低生物风险等特点,而且还可以开展遗传进化、追踪溯源、分子流行病学等多种研究.到目前为止,还未见有哪一种分子分型方法完全能够取代传统的布鲁菌分型方法.因此,在进行布鲁菌的分型鉴定时,应因地制宜、结合实际,应多法并用,相互参考,尽可能多的提供相关的信息,为布鲁菌病预防和控制提供科学的理论依据.

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S852.61+4

A

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2015-09-28

新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划(201311102)

刘帅(1992-),男,硕士生,主要从事动物疫病诊断与防控研究,E-mail:312447562@qq.com

易新萍,E-mail:yxp0925@sina.com