哺乳动物卵母细胞凋亡机制研究进展

马鲜平，毕俊萱，龙安格，陈奕熹，滕果洲，易华山

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆402460）

哺乳动物卵母细胞凋亡机制研究进展

马鲜平，毕俊萱，龙安格，陈奕熹，滕果洲，易华山＊

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆402460）

摘 要：细胞凋亡是细胞程序性死亡过程，在生殖细胞的发生过程中具有重要作用。哺乳动物卵母细胞在生长发育过程中，除排卵受精的成熟卵母细胞外，其他卵母细胞在卵泡发育的不同阶段凋亡。作者综述了卵母细胞的发育与细胞凋亡、细胞凋亡的主要参与分子及凋亡途径等研究进展，旨在为进一步研究哺乳动物卵母细胞的生长、发育和排卵机制提供帮助。

关键词：线粒体；死亡受体；卵母细胞；细胞凋亡

哺乳动物卵巢主要是生成卵细胞（即卵子，ovum）和分泌性激素，从而实现卵泡的发育、排卵、受精及早期胚胎发育。细胞凋亡（apoptosis）是细胞程序性死亡过程，是生命发育过程中的基本现象，在生殖细胞（germ cells）的发生过程中具有重要作用［1］。在哺乳动物中，卵原细胞（oogonia）通过增殖和分化形成初级卵母细胞，一个初级卵母细胞经过减数第一次分裂形成一个次级卵母细胞（MⅠ），次级卵母细胞减数第二次分裂形成一个成熟卵母细胞（即卵细胞）；不到1%的卵原细胞（oogonia）进入减数分裂（meiosis）产生初级卵母细胞（primary oocyte），而成熟卵母细胞由极少数优势卵泡内的卵母细胞发育而成，在卵巢卵泡发育过程中绝大部分卵泡闭锁退化，到排卵时只有一个、几个或十几个（猪），超过99.9%的卵母细胞在卵子发生的不同阶段发生凋亡［1－3］。作者就哺乳动物卵母细胞发育、主要凋亡分子及凋亡通路等方面的研究进展进行了综述。

1 哺乳动物卵母细胞的发育与细胞凋亡

1.1原始生殖细胞与初级卵母细胞的发育

在哺乳动物胚胎发育时期，原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）进行一系列有丝分裂而大量增殖分化为卵原细胞，通过有丝分裂而大量增殖后，进入卵原细胞的第一次减数分裂成为初级卵母细胞而形成原始卵泡［4］。初级卵母细胞在经第一次减数分裂的分裂前期的各个阶段后，直到出生前都阻滞在第一次减数分裂的双线期阶段（也叫前Ⅰ期阻滞）［1－3］。这些双线期卵母细胞同外周颗粒细胞环绕与包裹下形成透明带（zona pellucida）而保护卵子的发育。因哺乳动物物种和卵泡内激素环境的不同，卵母细胞双线期阻滞持续的时间也不相同，由几个月到几十年不等［3］。然而大多数初级卵母细胞就一直阻滞在这一时期还未等成熟就通过细胞凋亡机制退化；在哺乳动物个体达到性成熟后，在促性腺激素的作用下，进入成熟分裂周期而完成第一次减数分裂，并继续发育至第二次减数分裂直至中期（meiosisⅡ，MⅡ）即成为一个成熟的卵母细胞而具有受精能力，如果不受精将在MⅡ维持数小时后退化［3］。

1.2卵母细胞发育与微环境

卵母细胞是在卵泡内成熟的，卵泡细胞主要包括膜细胞、颗粒细胞和卵丘细胞，这些卵泡细胞为阻滞期的卵母细胞提供营养、生长成熟的因子及信号分子等［2－3］。卵母细胞体外培养研究发现，卵泡内颗粒细胞凋亡和／或卵母细胞生长因子、营养分子及存活因子的剥夺都导致卵母细胞的凋亡［3］。在体外，颗粒细胞可有效地保护卵母细胞免予氧化应激（oxidative stress，OS）损伤；活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生或抗氧化系统的缺失都易导致卵母细胞的凋亡，也有研究表明颗粒细胞的凋亡也是评价卵母细胞质量的重要影响因素［3－5］。

1.3卵母细胞的成熟与排卵

卵泡发育至排卵期，囊状卵泡破裂，产生处于阻滞在MⅡ期的优势卵母细胞；一旦排卵，这些卵泡具有第一极体而等待受精；如果受精过程不能发生，在排卵后老化或随后的MⅢ期自发激活进入卵母细胞的阻滞或细胞凋亡［3－4］。研究结果表明，好的卵母细胞在生殖过程中首先排卵；在人类随着母体老化的发生，卵母细胞更易朝着有限生殖的结局发展［3］。因此，人类和哺乳动物卵子发生过程中生殖细胞的消除及卵巢存贮的生殖细胞衰竭过程中，细胞凋亡扮演一个非常重要的角色［3－5］。

2 卵母细胞凋亡的细胞内环境与主要参与分子

2.1颗粒细胞与内部微环境

颗粒细胞决定卵母细胞生存的内部微环境，卵母细胞发育所需的各种信号分子、生存因子和生长因子的剥夺，都易激发卵母细胞的凋亡［3］。研究结果表明，过早的移除包裹于卵母细胞周围的颗粒细胞，或颗粒细胞的凋亡都影响卵母细胞的减数分裂和发育而增加卵泡内卵母细胞凋亡的敏感性；降低卵泡内卵母细胞和颗粒细胞之间的信号传导会干扰cAMP、cGMP和NO分子向卵泡卵母细胞内转移的水平［5］。这些信号分子的降低可激发双线期的卵母细胞产生ROS分子，这也进一步支持了双线期卵母细胞比MⅡ期卵母细胞对H2O2诱导的细胞凋亡更加敏感的理论［5］。有研究结果表明增加可诱导NO合成酶的表达而产生的NO可诱导卵母细胞的凋亡［3，5］。

2.2Ca2＋

Ca2＋也是影响卵母细胞生理功能的一个重要因素。细胞内高水平的Ca2＋可诱导有丝分裂细胞周期的阻滞和细胞凋亡，异常高的Ca2＋水平直接导致细胞的死亡［3，6］。小鼠、猪和牛卵母细胞体外培养试验结果表明，Ca2＋载体（CI）可增加细胞浆自由Ca2＋水平，通过线粒体重建和线粒体膜的去极化而导致卵母细胞凋亡［3，7］。Tiwari等［3］研究结果表明，CI是通过增加细胞内Ca2＋水平诱导活性氧（ROS）的产生而导致小鼠卵母细胞的凋亡，cAMP和cGMP水平的降低也可增加Ca2＋水平而诱导ROS产生。

2.3活性氧

ROS持续产生可导致氧化应激（OS）。OS降低了双线期和MⅡ阻滞期卵母细胞内的存活因子和诱导促成熟因子（maturation promoting factor，MPF）的不稳定性，MPF稳定性需要Cdk1的磷酸化和去磷酸化，Cyclin B1的分离和降解等一系列过程［3，8］。Tiwari等［3］研究表明应用核抑制剂（roscovitine）抑制Cdk1的活性诱导减数分裂细胞周期阻滞和凋亡很可能是通过调节MPF异源二聚体水平而实现的；MPF的不稳定性可从MⅡ阻滞期激发自发的通道，持续降低MPF的不稳定水平可激发卵母细胞的凋亡［3，5］。近年研究结果表明，OS压力是导致卵母细胞凋亡的主要因素之一［7，9］。

2.4细胞色素C

细胞色素C从细胞内释放，激活细胞内相关凋亡Caspase的上调或下调而导致卵母细胞的凋亡［7］。Caspase是半胱氨酸天冬氨酸酶依赖的家族，活化的Caspase剪切细胞内的多肽导致细胞内结构破坏而导致细胞凋亡［9］。在卵母细胞内活化的Caspase－3可特异性地降解底物的结构和特定蛋白，导致DNA损伤而产生180～200bp DNA Ladder，产生卵母细胞凋亡特征［3，9］。

2.5ATP分子

排卵后的卵母细胞，在体内和体外培养条件下，ATP水平的降低可导致ROS的产生及抗凋亡因子Bcl－2表达的下调［5］。Bcl－2因子的降低导致促凋亡因子，如Bcl－2相关的X蛋白（Bcl－2－associated X protein，BAX）和Bcl－2杀伤蛋白（Bcl－2antagonist or killer，BAK）及BH3－only等的增加而导致卵母细胞凋亡，这些促进卵母细胞间接发生细胞凋亡的因子被称为促凋亡因子［3，10］。这些促凋亡因子是哺乳动物卵巢中细胞凋亡所必需的介质分子；而细胞凋亡的进行使卵母细胞不断从卵巢生殖细胞贮存中消耗［3－5］。

3 卵母细胞的凋亡通路

哺乳动物卵母细胞的凋亡研究中，线粒体凋亡途径（mitochondria pathway）以ROS的产生而介导；死亡受体途径（death receptor pathway）以FasL和TNF－α作用于相应的受体而激发细胞表面的死亡受体，死亡受体的激活及Caspase的参与导致卵母细胞凋亡，而内质网途径（endoplasmic reticulum pathway）研究相对较少［3，11］。

3.1线粒体凋亡内源性通路

线粒体凋亡内源性通路，又称线粒体凋亡通路。在卵母细胞中，细胞色素C、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）、Bax、BH3－only蛋白等位于线粒体内膜空间（intermembrane space，IMS）［3－4］。卵母细胞内cAMP及cGMP水平的降低导致ROS水平升高；细胞内自由Ca2＋水平及CI可诱导卵母细胞产生H2O2，这种ROS水平的增加调控线粒体膜Bax／Bcl2蛋白的表达水平而影响线粒体膜电位变化［8，12］。在BH3－only蛋白，如一种截短的BID（tBID）可诱导Bax的过表达，Bax蛋白从细胞质转位到线粒体，Bak蛋白通过寡聚化诱导线粒体内膜的通透性发生改变，使线粒体IMS中细胞色素C蛋白释放，这些从IMS释放的细胞色素C同细胞内凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf1）结合而激活Caspase9活性，再进一步激发下游的凋亡级联反应，随着效应Caspase3、Caspase7的激活而激发线粒体凋亡途径［3－4，13］。

3.2死亡受体介导的外源性通路

在外源性凋亡途径中，死亡信号的转导依赖于死亡配体（death ligands）与受体（death receptor）的结合及受体的死亡效应结构域（death effector domain，DED）与信号转导分子的结合，细胞死亡信号蛋白（FasL和TNF－α）黏附到与其同源的细胞表面的受体分子（Fas和TNFR1）［3，14］。研究结果表明截短的Thr－161磷酸化Cdk1分子，同细胞周期蛋白B1使MPF不稳定，促使FasL介导的卵母细胞的凋亡；FasL浓度的升高导致Fas受体的三聚化及FADD链接分子的招募，形成死亡效应结构域［3，13－15］。在FADD招募中，Caspase－8酶原寡聚化而激活线粒体细胞凋亡途径［15］。研究结果表明，在凋亡刺激下，颗粒细胞sFasL释放，经NADPH氧化酶激活而产生氧化应激激活Fas凋亡通路；激活的Fas再激发Ca2＋释放而激活钙离子／钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）和Caspase－3活性［16－17］。CaMKⅡ的激活又促进了Ca2＋释放而激活Caspase－3活性而导致卵母细胞的凋亡。因此，FasL／Fas信号调控通路是通过氧化应激产生Ca2＋释放和Caspase3活性的激活［16－19］。卵母细胞在受到死亡信号刺激，如DNA损伤、化疗试剂、UV照射、失去了赖以生存的生长因子、细胞周期阻滞毒素和ATP不足等刺激时，可通过死亡受体介导的Caspase－8激活tBid将凋亡信号转导至线粒体途径［3，11，13］。这些促凋亡的BH3－only蛋白（BID）在卵巢内也扮演着细胞凋亡的关键调控因子，是线粒体途径和死亡受体途径的纽带［3－4，7］。

3.3内质网凋亡途径

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是卵母细胞内重要的细胞器，参与蛋白合成、折叠和寡聚化、钙的存储、脂类代谢、类固醇代谢的合成等［11］。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）也就是一些病理生理刺激，如氧化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱、辐射及线粒体功能紊乱及病毒感染等，可导致内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白的蓄积及Ca2＋平衡紊乱而导致细胞凋亡［3，11］。研究已表明在卵母细胞的ERS包括CHOP基因的激活转录通路、JNK／JUN激活通路及内质网特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase－12凋亡通路［12，20］。CHOP通路是通过诱导ATF2、ATF4及ATF6α而激发卵母细胞的凋亡［12］。JNK／JUN通过p38MAPK14和p53的激活而调节下游凋亡相关基因的转录和表达而激活死亡受体途径及线粒体凋亡途径［20－21］。在正常细胞中，Caspase－12以无活性的酶原形式存在于内质网中，是介导内质网应激凋亡的关键分子［12，20］。如Calreticulin是内质网腔主要的结合Ca2＋的分子伴侣，调节细胞内Ca2＋的动态平衡［20］。在ERS损伤刺激下，Ca2＋动态平衡被破坏，Caspase－12酶原通过IRE1的磷酸化，激活TRAF2及ASK1活性而使Caspase－12酶原被激活［12，20－21］。活化的Caspase－12与其他应激分子激活Caspase－9酶原及Caspase－3酶原而引致细胞凋亡［12，20－21］。

4 展 望

大量的卵母细胞在卵子发生的不同阶段通过细胞凋亡而调控卵母细胞的成熟与排卵，但对卵母细胞细胞凋亡进程中参与的凋亡分子及其在凋亡途径中的作用机制有待进一步深入研究。特别是卵母细胞在双线期、MⅠ期、MⅡ期及MⅢ阻滞期是如何被诱导、调控细胞凋亡的机制亟需深入研究。内质网作为信号传导的枢纽，ERS在细胞凋亡过程中也发挥着重要作用，因此亟待卵母细胞内内质网介导的凋亡通路的深入研究，以完善卵母细胞内细胞凋亡通路及其调控机制。

研究表明，赭曲霉毒素通过上调p53及p21的表达激活细胞凋亡而影响小鼠卵母细胞的成熟及胚胎的发育［22］。糖皮质类激素通过激活Fas细胞凋亡通路而诱导卵巢细胞的凋亡，如类胰岛素类生长因子，脑源性神经营养因子及糖皮质激素受体在颗粒细胞内的表达，促进在血清和卵巢中糖皮质激素水平的提高，出现卵丘细胞和颗粒细胞及卵母细胞的凋亡［23］。印楝质农药是目前极有发展前途的植物源生物农药，以其优秀的杀虫特性逐渐受到重视，但印楝叶提取物可诱导ROS产生及线粒体介导小鼠卵泡中颗粒细胞及卵泡细胞的凋亡［24］。

卵母细胞的凋亡是卵巢内生殖细胞清除的主要因素之一，对哺乳动物雌性动物，包括人类的生育具有重要的影响。胚胎干细胞的发现开辟了一个新的研究卵子发生的方法，可通过卵巢干细胞来增加卵母细胞的数量而进行一系列的研究，但重点是阻止卵母细胞由于环境的变化、病理条件下或药物治疗而通过凋亡从卵巢中丧失及如何将卵巢内卵母细胞早期的损失进行有效的保护，获得大量高质量的卵母细胞以提高哺乳动物包括人类的繁殖状况［3，25］。

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（责任编辑 董晓云）

中图分类号：Q952

文献标识码：A

文章编号：1671－7236（2016）12－3263－05

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.027

收稿日期：2016－04－15

基金项目：中央高校基本业务费专项资金资助项目（XDJK2013C139、XDJK2015C032）

作者简介：马鲜平（1981－），女，甘肃文县人，硕士，讲师，研究方向：家畜解剖学及组织胚胎学，E－mail：xianpingma＠126.com

通信作者：＊易华山（1980－），男，甘肃临夏人，博士，讲师，研究方向：细胞遗传与细胞工程，E－mail：dyxyihuashan＠swu.edu.cn

Advance of Apoptotic Mechanism in Mammalian Oocyte

MA Xian－ping，BI Jun－xuan，LONG An－ge，CHEN Yi－xi，TENG Guo－zhou，YI Hua－shan＊
（DepartmentofAnimalMedicine，RongchangCampusofSouthwestUniversity，Chongqing402460，China）

Abstract：Apoptosis is programmed cell death process，which plays an important role in the process of development of germ cells.In the process of growth and development of mammalian oocytes，in addition to the mature ovulation fertilization of the oocytes，the others are apoptotic at different stages of follicular oocytes.This paper summarizes the research progress of development of the main apoptosis mechanism and apoptosis pathway of mammalian oocytes，and lays a foundation for further studying growth，development and ovulation mechanism of oocytes.

Key words：mitochondria；death receptors；oocyte；apoptosis