产丝氨酸蛋白酶芽胞杆菌的鉴定及其生防作用

唐　娜， 陶树兴*， 梁　健， 冯晓磊, 户引红， 许真珍， 熊　平

(1 陕西师范大学 生命科学学院， 陕西 西安 710119；

2 渭南德龙生物科技有限公司，陕西 渭南 714000)



产丝氨酸蛋白酶芽胞杆菌的鉴定及其生防作用

唐娜1， 陶树兴1*， 梁健1， 冯晓磊1, 户引红2， 许真珍1， 熊平1

(1 陕西师范大学 生命科学学院， 陕西 西安 710119；

2 渭南德龙生物科技有限公司，陕西 渭南 714000)

摘要：为筛选丝氨酸蛋白酶产生菌用于生物防治，利用丝氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA和特异性抑制剂PMSF确定产丝氨酸蛋白酶菌株，依据形态特征、生理生化特性和16S rDNA比对分析对菌株进行鉴定，用对峙法、抑菌圈法和液体振荡培养法观察抗植物病原真菌的作用，用96孔板法观察抗线虫作用。实验筛选到产丝氨酸蛋白酶的芽胞杆菌SNUB19，鉴定结果为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，该菌株发酵液的无菌滤液对尖孢镰刀菌等植物病原真菌有显著的抑制作用，对南方根结线虫有较强的致死效应。

关键词：丝氨酸蛋白酶； 芽胞杆菌； 菌种鉴定； 植物病原真菌； 南方根结线虫

随着耕地面积的减少和保护栽培的发展，作物连作不可避免。作物连作中由植物病原真菌和根结线虫引起的土传病害是造成作物减产和品质下降的重要原因，世界上每年由此造成的农业生产损失达上千亿美元[1-2]。目前，作物土传病害的防治主要采取物理防治、化学防治和生物防治3种防治措施，物理防治的防效较低，化学防治中有害物质残留较高,因此生物防治受到广泛重视[3]。丝氨酸蛋白酶是一类活性中心含有丝氨酸的蛋白酶，它可以水解特殊底物Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BApNA)并受苯甲基磺酰氟(PMSF)特异性抑制[4-5]。丝氨酸蛋白酶属于碱性蛋白酶，作用的最适pH值一般为8~10[6]。目前丝氨酸蛋白酶的研究与应用非常活跃，产丝氨酸蛋白酶微生物在植物病原真菌和根结线虫生物防治中的应用已引起广泛关注[7]。本实验室从多年连作大棚栽培的番茄根际土壤中筛选到两株丝氨酸蛋白酶产生菌SNUB18和SNUB19，SNUB18为假单胞菌(Pseudomonassp.)，SNUB19为芽胞杆菌(Bacillussp.)。本文报道SNUB19的鉴定结果及其对植物病原真菌的抑菌作用和对南方根结线虫的致死效应。

1材料和方法

1.1实验菌株和线虫

芽胞杆菌(Bacillussp.)SNUB19：为本实验室从多年连作大棚栽培的番茄根际土壤中分离获得。

植物病原真菌：玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)PF3、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)PF4、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeospori-oide)PF5、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici) PF6、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)PF8，由西北农林科技大学植物保护学院提供；香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)Foc4-1，由中国热带农业科学院生物技术研究所提供；尖孢镰刀菌(F.oxysporum)SNUF9，为本实验室保藏菌株。

南方根结线虫(Meloidogyneincongnita(Kofold&White) Chitwood)：2龄幼虫由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。

1.2培养基

PDA培养基、干酪素培养基、脱脂牛奶培养基、玉米粉液体发酵培养基按文献[8]配制。

1.3主要化学试剂

Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BApNA)为Sigma公司产品；苯甲基磺酰氟(PMSF)购自国药集团化学试剂有限公司；EDTA、Triton x-100购自天津市登峰化学品有限公司；干酪素蛋白胨、牛肉膏、MgCl2、MgSO4·7H2O、NaCl、Na2CO3、NaCl、三羟甲基氨基甲烷、三氯乙酸、冰乙酸等均为分析纯试剂；伊利脱脂牛奶为市售产品。

1.4主要仪器设备

E600型Nikon ECLIPSE相差显微镜，SZX-ILLK200型解剖显微镜，日本Nikon公司产品；SW-CJ-1CU型洁净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；H2Q-F100型全温震荡培养箱，太仓市实验设备厂。5415R台式冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司；Sigma 3-18k型离心机，Sigma离心机有限公司；MF1型自动菌落计数仪，杭州讯数科技公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司； 0.22 μm微孔滤膜，迈博瑞生物膜技术有限公司；牛津杯，上海东方药品科技实业有限公司；96孔板，USA costar。

1.5丝氨酸蛋白酶产生菌的筛选

制备土壤样品悬液，用脱脂牛奶平板分离产蛋白酶菌株。将获得的产蛋白酶菌株经纯化后，通过液体振荡培养和离心制备粗酶液，用丝氨酸蛋白酶特殊底物BApNA和特异性抑制剂PMSF确定菌株所产蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶[4-5]。

1.6丝氨酸蛋白酶产生菌的鉴定

形态学观察： 将丝氨酸蛋白酶产生菌涂布于脱脂牛奶培养基平板上，28 ℃培养48～72 h，观察记录菌落形状、大小、颜色、边缘、表面光滑度等。用常规制片法和染色法观察细胞的形状、大小、两端形状、细胞排列方式、芽胞及位置等。

生理生化特性测定：按文献方法进行[9-10]。

16s rDNA 序列分析与系统学分析: 16s rDNA基因序列分析由上海生工生物工程有限公司完成；基因比对采用美国国家生物技术信息中心NCBI数据库BLAST在线完成，系统学分析建树采用软件MEGA4.1完成。

1.7抗植物病原真菌的观察

用平板对峙法、牛津杯法测定SNUB19对7株植物病原真菌的抗菌谱，用凹载玻片培养法、载玻片培养法和液体培养基振荡培养法探讨SNUB19对尖孢镰刀菌SNUF9的抑菌机理[11]。

1.8抗南方根结线虫试验

实验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所完成。将芽胞杆菌SNUB19的发酵液离心、除菌过滤得到无菌上清液，用96孔板每孔加入10 μL线虫悬液后再加入190 μL无菌上清液，置28 ℃孵育，定时观察线虫存活情况，拍照，统计死亡率。

校正死亡率(%)=(处理组死亡率—对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)×100%。

1.9数据分析

采用SPSS 20.0统计分析软件完成。

2结果分析

2.1丝氨酸蛋白酶产生菌的筛选和鉴定

2.1.1丝氨酸蛋白酶产生菌的筛选从多年连作大棚栽培的番茄根际土壤中分离获得的芽胞杆菌(B. sp.)SNUB19在脱脂牛奶平板上菌落呈不规则形，边缘不整齐，为不透明的白色，表面干燥，无金属光泽，蛋白质水解圈清晰可见(图1)。酶的最适pH为8.0。采用丝氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA，特异性抑制剂PMSF对酶的抑制率为91.50%±0.13%，而EDTA 和Triton X-100对蛋白酶的抑制率分别为23.10%±0.61%和17.60%±0.46%，可以初步认定菌株SNUB19所产蛋白酶为丝氨酸蛋白酶。

a.平板涂布　　　　　　　b.平板点接

2.1.2芽胞杆菌SNUB19的鉴定芽胞杆菌SNUB19的菌体为杆状，宽0.7～0.8 μm，长2～3 μm，革兰氏染色为阳性(图2a)，培养3 d后菌体内形成芽胞，芽胞位于菌体的中间或位于菌体的一端，芽胞宽0.6～0.8 μm，长1.0～1.5 μm(图2b)。

图2 芽胞杆菌SNUB19的形态特征

芽胞杆菌SNUB19的生理生化特性见表1。

表1 芽胞杆菌SNUB19的生理生化特性实验结果

芽胞杆菌SNUB19测序得到的16s rDNA序列长度为1432bp，将序列经NCBI数据库BLAST在线比对，结果显示菌株SNUB19在系统进化树中与Bacillussubtilis(登录号HQ678671.1)的亲缘关系最近(图3)。根据芽胞杆菌SNUB19的形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》[9-10]，丝氨酸蛋白酶产生菌SNUB19鉴定结果为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。

图3 芽胞杆菌SNUB19系统进化分析

2.2枯草芽胞杆菌SNUB19的抗真菌作用

2.2.1枯草芽胞杆菌SNUB19对7种植物病原真菌的抑制作用采用平板对峙法测定枯草芽胞杆菌SNUB19对7种植物病原真菌抑菌区的宽度，经方差分析，F=180.34，明显大于F(2,6)=10.93，差异极显著；用牛津杯法测定SNUB19的无菌滤液对7种植物病原真菌的抑菌圈直径，经方差分析F=154.951，远大于F(6,14)=2.85，差异极显著；两种方法均证实枯草芽胞杆菌SNUB19对7种植物病原真菌有不同程度的抑菌作用，其中对玉米大斑病菌PF3、番茄灰霉病菌PF4、葡萄炭疽病菌PF5和辣椒炭疽病菌PF6的抑制作用较强(见表2)。

表2 枯草芽胞杆菌SNUB19对植物

注：同列数值后相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.2.2枯草芽胞杆菌SNUB19对尖孢镰刀菌的抑菌机理探讨

(1)枯草芽胞杆菌SNUB19对尖孢镰刀菌SNUF9孢子萌发的影响

图4是采用凹玻片培养法观察枯草芽胞杆菌SNUB19无菌滤液对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响。统计表明，培养6 h对照组孢子萌发率为8.64，处理组为5.88，差异显著(P<0.05)；培养36 h对照组孢子萌发率为73.16，处理组为19.67，差异极显著(P<0.01)。

图4 芽胞杆菌SNUB19无菌滤液对

a、b为尖孢镰刀菌SNUF9对照，分别培养6 h、36 h；c、d为尖孢镰刀菌SNUF9加SNUB19无菌滤液处理，分别培养6 h、36 h。

(2)枯草芽胞杆菌SNUB19对尖孢镰刀菌SNUF9菌丝生长的影响

图5是采用平板对峙法观察枯草芽胞杆菌SNUB19对尖孢镰刀菌SNUF9的影响，可见尖孢镰刀菌SNUF9菌落两端菌丝生长受到抑制，抑菌区距离达9.62 mm，说明芽胞杆菌SNUB19对尖孢镰刀菌SNUF9有抑制作用。

图5　枯草芽胞杆菌SNUB19对尖孢镰刀菌的拮抗作用

图6是用载玻片培养定时观察枯草芽胞杆菌SNUB19无菌滤液对尖孢镰刀菌SNUF9菌丝生长的影响，SNUF9主要表现为菌丝分支和菌丝数目明显减少，菌丝老化，提前形成孢子，另外也发现少数菌丝膨大畸变。

图6 枯草芽胞杆菌SNUB19无菌滤液对

a、b为尖孢镰刀菌SNUF9对照，分别培养12 h、36 h; c、d为尖孢镰刀菌SNUF9经SNUB19无菌滤液处理，分别培养12 h、36 h。

表3是将枯草芽胞杆菌SNUB19的无菌滤液加入液体培养基进行振荡培养，观察尖孢镰刀菌SNUB19菌丝干重和离心上清液吸光度的变化。结果表明，实验组的菌丝干重比对照组有明显下降，离心上清液在260 nm和280 nm处的吸光度比对照组高，这些变化说明枯草芽胞杆菌SNUB19的无菌滤液能使尖孢镰刀菌SNUF9的菌丝生长受到抑制，使部分菌丝破裂，细胞内物质外流。

2.3枯草芽胞杆菌SNUB19对南方根结线虫的作用

将南方根结线虫二龄幼虫与枯草芽胞杆菌SNUB19的无菌滤液混合，结果发现，在28 ℃孵育8 h时，幼虫全部麻痹；孵育24 h，幼虫全部失去活力，沉于孔底，无法计数(图7)。孵育4 h、8 h和16 h南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率及方差分析结果分别为：(27.25±1.36)%，(61.84±1.11)%，(91.59±1.01)%，不同时间之间校正死亡率差异极显著(P<0.01)。

孵育16 h时，二龄幼虫的校正死亡率大于90%，说明枯草芽胞杆菌SNUB19的无菌滤液对南方根结线虫二龄幼虫有较强的杀虫效应。

表3 枯草芽胞杆菌SNUB19无菌滤液对

*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

图7 枯草芽胞杆菌SNUB19无菌滤液对

a、b、c为南方根结线虫清水对照组，分别培养4h、8h、16 h； d、e、f为南方根结线虫经SNUB19无菌滤液处理，分别培养4 h、8 h、16 h。

3讨论

枯草芽胞杆菌对人和环境安全，容易培养，生产的生防菌剂在防治土传真菌病害方面已得到广泛应用[12]。本实验室以尖孢镰刀菌为靶标筛选的枯草芽胞杆菌SNUB16，能产生抗真菌物质，对多种植物病原真菌有很好的防治效果[11]。本研究筛选的丝氨酸蛋白酶产生菌枯草芽胞杆菌SNUB19对多种植物病原真菌有抑制作用，抗菌谱较广，同时也丰富了抗植物病原真菌生防菌株的筛选策略。枯草芽胞杆菌SNUB19能抑制尖孢镰刀菌SNUF9的孢子萌发、使菌丝分支和菌丝数目减少，菌丝提前老化，提前形成孢子，少数菌丝膨大畸变，这些作用可能与丝氨酸蛋白酶作用于新形成的细胞结构成分有密切关系。

丝氨酸蛋白酶的应用非常广泛，目前在抗根结线虫方面，主要集中在基于宏基因组学(Metagenomic) 的丝氨酸蛋白酶基因的克隆、表达和抗线虫活性研究，这代表了当前的研究方向[13-15]。由于工程菌的安全认证严格且时间较长，而根结线虫的危害日益严重，加之化学防治对土壤和农产品的残留受到人们的关注，筛选对人和环境安全的抗根结线虫微生物用于生物防治，是一项非常迫切的工作。淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)是目前防治根结线虫的重要生防真菌[16]，该菌能产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶,并通过这两种酶的作用破坏根结线虫的卵壳,菌丝侵入虫卵并在卵内寄生。本实验室曾筛选到产几丁质酶的枯草芽胞杆菌2-3-2，对南方根结线虫有较强的杀虫作用[17]，产丝氨酸蛋白酶的枯草芽胞杆菌SNUB19不仅对南方根结线虫2龄幼虫有较强的杀虫活性，在抗虫实验中，也发现该菌株能降低南方根结线虫虫卵的孵化率。枯草芽胞杆菌2-3-2和枯草芽胞杆菌SNUB19同时使用有无协同作用，还有待研究。

已有的研究表明，土传真菌病害与根结线虫危害常常同时发生且相互影响导致危害加重[18]。产丝氨酸蛋白酶的枯草芽胞杆菌SNUB19，对多种植物病原真菌有抑制作用，同时对南方根结线虫也有较强的杀虫活性，显示该菌株有重要的应用前景。

4结论

从多年连作大棚栽培的番茄根际土壤中分离获得的芽胞杆菌(Bacillussp.)SNUB19，能产生碱性蛋白酶，该酶以丝氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA为底物时，受特异性抑制剂PMSF的抑制率高达91.2%，确认SNUB19为丝氨酸蛋白酶产生菌。通过形态学观察、生理生化实验和16s rDNA序列分析，SNUB19鉴定为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。SNUB19的发酵上清液对玉米大斑病菌PF3、番茄灰霉病菌PF4、葡萄炭疽病菌PF5和辣椒炭疽病菌PF6等植物病原真菌有显著的抑制作用，可抑制尖孢镰刀菌孢子萌发、菌丝生长，对南方根结线虫2龄幼虫也有较强的杀虫效应。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)SNUB19是一株具有抗植物病原真菌和杀根结线虫双重功效的生防菌株，有重要的应用价值。

致谢：本文抗线虫实验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所完成，茆振川老师和凌键老师给予热情帮助和指导，特表示感谢！

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〔责任编辑王勇〕

第一作者：李武斌，男，讲师，博士研究生，主要研究方向为人文与城市地理。E-mail:liwubin2000@sina.com

Identification and biocontrol effect of a novel bacillus with producing serine protease

TANG Na1, TAO Shuxing1*, LIANG Jian1, FENG Xiaolei1,

HU Yinhong2， XU Zhenzhen1， XIONG Ping1

(1 School of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China；

2 Weinan Delong Biotech Co., Ltd.，Weinan 714000， Shaanxi, China )

Abstract:In order to select bacteria with producing serine protease for biological control, BApNA, the particular substrate of serine protease and selective inhibitor PMSF were used to confirm serine protease productivity. Morphological characteristics, physiological, biochemical characteristics and 16s rDNA comparison analysis were used for strain identification. Antagonistic method, inhibition zone method and liquid shake culture were introduced to observe the resistant effect of the bacteria on plant pathogenic fungi. 96-well plate assay was used to observe the resistant effect the bacteria on nematodes. SNUB19, a bacillus with producing serine protease was screened in the experiment and was identified as Bacillus subtilis. The fermentation broth of this strain is significantly resistant to plant pathogenic fungi and is relatively fatal to Meloidogyne incognita.

Keywords:serine protease; bacillus; strain classification; plant pathogenic fungi; Meloidogyne incognita

通信作者：*薛东前，男，教授，博士生导师。E-mail::xuedq@snnu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金 (41171142)；科技基础性工作专项(2014FY210100)

收稿日期：2015-05-05

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.01.411

文章编号：1672-4291(2016)01-0087-09

中图分类号：Q939.96

文献标志码：A