丁苯酞改善血管性痴呆大鼠认知功能及其对海马区GAP-43和突触素表达的影响

2016-02-01陈庆友王中华

中国老年学杂志 2016年8期

关键词：丁苯血管性海马

陈庆友　师　岩　王中华

(齐齐哈尔医学院附属第三医院神经内科，黑龙江　齐齐哈尔　161000)

丁苯酞改善血管性痴呆大鼠认知功能及其对海马区GAP-43和突触素表达的影响

陈庆友师岩1王中华2

(齐齐哈尔医学院附属第三医院神经内科，黑龙江齐齐哈尔161000)

〔摘要〕目的探讨丁苯酞对血管性痴呆(VD)大鼠认知功能及对海马区GAP-43和突触素P38表达的影响。方法选取雄性Wistar大鼠90只，随机分为观察组、对照组、空白组各30只。空白组不采取任何操作；对照组大鼠制成VD模型，并予以生理盐水；观察组大鼠制成VD模型后，予以丁苯肽注射液。治疗1个月后，采取MG-Y-型迷宫检测其认知功能以及采用Western印迹和RT-PCR分别检测大鼠海马区内GAP-43和突触素P38的表达。结果观察组和空白组大鼠的错误反应次数均明显低于对照组(P均<0.05)，且空白组大鼠降低更明显(P<0.05)。对照组和观察组的GAP-43在大鼠海马区内的mRNA中表达较空白组高(P均<0.05)，且观察组表达程度较对照组更高(P<0.05)；观察组的突触素P38在大鼠海马区内的mRNA中表达较空白组和对照组均提高(P均<0.05)，而对照组和空白组之间表达无差异(P>0.05)；观察组GAP-43在大鼠海马区内的蛋白中表达较对照组和空白组均提高(P均<0.05)，对照组和空白组之间表达无差异(P>0.05)；对照组和观察组的突触素P38在大鼠海马区内的蛋白中表达较空白组均提高(P均<0.05)，且观察组表达程度较对照组更高(P<0.05)。结论对于VD大鼠，可予以丁苯酞注射液治疗，其可促进神经元的修复及再生，改善VD大鼠海马区GAP-43及突触素P38的表达，从而提供其认知功能，改善其预后。

〔关键词〕丁苯酞；血管性痴呆；认知功能；GAP-43；突触素P38

血管性痴呆(VD)的发病率近年来持续上升，现已成为中老年人常见病之一，在我国其患病率已达2.1%～3.5%〔1，2〕。而目前针对VD的治疗方法主要是通过促进脑部微循环，改善血液灌注等对症治疗。丁苯酞注射液可以改善脑卒中患者的中枢神经系统损伤以及脑能量代谢和脑缺血区的微循环。但关于丁苯酞注射液是否可以改善VD患者症状的报道仍不多。本研究旨在探讨丁苯酞对VD大鼠认知功能及对海马区GAP-43和突触素P38表达的影响。

1材料与方法

1.1动物及分组普通级健康成年雄性SD大鼠90只(哈尔滨医科大学实验动物中心)，平均体重为(300.2±50.2)g，平均鼠龄(14.32±2.57)w。大鼠分笼饲养，正常光照，自由饮水和摄食，温度22℃，相对湿度50%～70%。将其随机分为观察组、对照组、空白组各30只。空白组不采取任何操作；对照组大鼠制成VD模型，并予以生理盐水；观察组大鼠制成VD模型后，予以丁苯酞注射液。

1.2试剂和仪器丁苯酞注射液(国药准字 p0100041，石药集团恩必普药业有限公司)，2次/d，150 ml/次，每次静注不少于1 h，两次用药时间间隔≥6 h，且只能使用PE输液器；GAP-43多克隆抗体(规格：0.2 ml，浓度1 mg/ml，上海安研生物有限公司)；突触素P38多克隆抗体(规格：0.2 ml，浓度1 mg/ml，上海华研生物有限公司)，SDS-PAGE试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)，Trizol 试剂盒(西安融智生物技术有限公司)、引物(上海乔羽生物科技有限公司)，MG-Y-型迷宫试验装置(安徽正华生物仪器设备有限公司)。

1.3制备VD模型本研究通过结扎颈总动脉的方法来制作VD大鼠模型。具体操作方法为：观察组大鼠于术前6～8 h禁食水，首先麻醉SD大鼠，向大鼠腹腔内按照400 mg/kg的剂量注射10%水合氯醛。待麻醉成功后，用大头针固定大鼠的四肢，使其成仰卧位。去除大鼠颈部的毛发，向上至下颌部，向下至锁骨，两侧至胸锁乳突肌外援2 cm处。先用碘伏消毒，其消毒范围大于去毛范围，而后用酒精擦拭干净。沿气管中线切约5 cm的切口，依次分离皮肤、软组织、肌肉直至显露两侧颈总动脉。分离过程中应小心操作，小心误伤迷走神经，用4-0 Dexon线分别结扎两侧颈总动脉的近心端及远心端，于其二者中间剪断颈总动脉。逐层缝合，于皮肤伤口缝合处予以红霉素预防感染。待大鼠状态稳定，清醒后活动无异常，将其送回至笼中。术后30 d即制成VD模型。对照组大鼠手术方法与观察组一致，区别为其只分离两侧颈总动脉。在制模的1个月内，三组大鼠所饲养的环境以及喂养食物均一致。经过1个月制备成模后，对照组大鼠予以注射生理盐水，观察组大鼠予以注射丁苯酚注射液，空白组大鼠不进行任何操作，按此方法治疗1个月。

1.4采用MG-Y-型迷宫检测认知功能在经过1个月的药物治疗后，采用MG-Y-型迷宫来检测各组大鼠之间认知功能的差别。MG-Y-型迷宫是由3条等长的臂组成的三等分辐射式迷路箱及控制仪组成，当按下控制仪的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按钮时，相应的Ⅰ臂、Ⅱ臂、Ⅲ臂信号灯亮，对应的亮灯的臂即为安全区，没有亮的臂以及交界处均为危险区〔3〕，在试验中大鼠若在受到刺激后，一次性的跳跃至安全区的范围，即记为一次正确反应，若大鼠未跳跃或者跳跃至危险区，则为错误反应。大鼠达标的标准为连续10次刺激中，大鼠有至少9次以上表现为正确反应。EN值即为大鼠达到达标标准之前的刺激次数。对于达标的大鼠，送其回笼休息18 h，而后记录大鼠刺激10次中的正确反应次数，此值记为CN值。EN值一般代表大鼠的学习能力，而CN值代表大鼠的记忆能力，二者结合则体现大鼠的认知功能。所有入组的大鼠均由同一医师在相同条件下进行检测。

1.5采集标本及观察指标的测量

1.5.1 采集标本在3组大鼠进行MG-Y-型迷宫后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，取出脑部组织，置于冰上，将海马组织分离出来，保存于-196℃的液氮中。分别检测三组大鼠海马组织内mRNA和蛋白中的GAP-43、突触素P38的含量，并加以比较。

1.5.2海马组织内mRNA中的GAP-43，突触素P38的检测采用Trizol试剂盒提取3组大鼠海马组织的总RNA，用RT-PCR的方法来测量其内的GAP-43、突触素P38的含量。设计的引物为：GAP-43：正义：5′AGGGAGATGGCTCTGCTAC 3′，反义：5′GAGACAGGGTTCAGGTGGG 3′，产物463 bp；突触素P38：正义：5′CAGCCGTGTTCGCTTTCA 3′，反义：5′TGCCCAGCCTGTCTCCTT 3′，产物为250 bp。RT-PCR的反应条件：98℃ 3 min，其之后的40个循环在98℃ 1 min，60℃ 1 min，75℃ 1.5 min的反应条件下进行，最后在75℃的条件下延伸10 min。记录各产物的溶解时间，最后在PCR仪上绘制其溶解曲线。电泳后，测量GAP-43，突触素P38与β-actin的相对灰度比值。

1.5.3海马组织内蛋白中的GAP-43，突触素P38的检测液氮中将保存的海马组织在4℃10 000 r/min离心10 min，取其上层清液，按照SDS-PAGE试剂盒的说明书进行分离操作，按照说明书标配的浓度进行凝胶的配置，用SDS-PAGE上样缓冲液沸水浴加热4 min后冷却至室温，而后进行电泳电压设置为100 V，时间设定为100 min。将转膜槽放置在冰水浴中进行转膜，转膜后放置到预先备好的Western洗涤液中封闭，经过抗体孵育后，测定Western印迹蛋白条带积分光密度值。

1.6统计学方法采用SPSS15.0软件行单因素方差分析和SNK法。

2结果

2.1三组大鼠认知功能的对比三组大鼠经过MGY-型迷宫测试后，观察组和空白组大鼠的错误反应次数〔(62.70±4.81)次，(49.50±5.19)次〕均明显低于对照组〔(81.86±5.15)次〕(P均<0.05)，且空白组大鼠降低更明显(P<0.05)；观察组和空白组大鼠的正确反应次数〔(7.30±1.87)次，(8.30±1.41)次〕均明显高于对照组〔(5.19±1.32)次〕(均P<0.05)。

2.2三组大鼠海马组织GAP-43、突触素P38 mRNA表达对照组和观察组的GAP-43在大鼠海马区内的mRNA中表达(1.11±0.04，1.57±0.03)较空白组(0.61±0.07)高(均P<0.05)，且观察组表达程度较对照组更高(P<0.05)；观察组的突触素P38在大鼠海马区内的mRNA中表达(1.91±0.02)较空白组(0.64±0.04)和对照组(0.87±0.06)均提高(均P<0.05)，而对照组和空白组之间表达无差异(P>0.05)。

2.3三组大鼠海马组织GAP-43，突触素P38蛋白表达观察组GAP-43在大鼠海马区内的蛋白中表达(2.61±1.24)较对照组(2.19±1.05)和空白组(2.18±1.15)均提高(P均<0.05)，对照组和空白组之间表达无差异(P>0.05)。对照组和观察组的突触素P38在大鼠海马区内的蛋白中表达(2.32±1.13，2.57±1.31)较空白组(2.70±1.14)均提高(P均<0.05)，且观察组表达程度较对照组更高(P<0.05)。

3讨论

VD多产生于脑卒中患者，这是由于其长期缺氧导致脑部血流灌溉不足，生成氧自由基及乳酸等物质，导致患者脑部神经元细胞被破坏，逐渐出现学习记忆能力下降，最终出现认知功能障碍，给家庭及社会带来严重困扰〔4〕。本研究结果说明经过丁苯酚注射液治疗的VD大鼠，其学习能力以及记忆能力得到提高，即其认知功能得到修复。

GAP-43是一种促进神经元修复与合成的轴突膜蛋白，曾作为首选的分子探针广泛用于神经元细胞修复等方面的研究。曾有研究报道，在损伤的神经元进行修复的过程中，GAP-43的表达增强，合成速度加快，并且随着GAP-43含量的增高，可促进神经元轴突的延伸〔5〕。GAP-43还可以作为细胞内信号传导介质，增强其与G蛋白耦联的受体转运作用〔6〕。这就说明神经系统损伤之后的修复再生过程中，GAP-43扮演了重要角色〔7〕。本研究结果说明VD大鼠在经过丁苯酚注射液的治疗后，其GAP-43在大鼠海马组织内mRNA及蛋白表达均有所提高，从而促进VD大鼠损伤的神经元细胞再生修复，缓解其脑部缺氧状态，改善不良症状。突触素P38与GAP-43类似，对于神经元的损伤修复、生长发育也有一定的作用。它是一种钙结合糖蛋白，其不仅可以促进神经元的损伤修复，还可以加快突触之间的传递速度，从而进一步加快神经元的生长发育〔8〕。本研究结果表明，丁苯酚注射液可提高突触素P38在大鼠海马组织内mRNA和蛋白中的含量，从而促进神经元损伤修复，加快神经传递的速度，改善大鼠认知功能。

综上所述，对于VD大鼠，可予以丁苯酞注射液治疗，其可促进神经元的修复及再生，改善VD大鼠海马区GAP-43及突触素P38的表达，从而提供其认知功能，改善其预后。

4参考文献

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3徐书雯，刘本胜，高广生，等.丁基苯酞对血管性痴呆大鼠记忆及海马Bcl-2、Bax的影响〔J〕.中华老年医学杂志，2011；30(6)：521-5.

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5吴玉彬，夏俊博，张艳萍，等.长春西汀合并高压氧治疗血管性痴呆疗效分析〔J〕.中国误诊学杂志，2012；12(17)：4559-60.

6吴娟，付朝晖，杨晋，等.丁苯酞对血管性痴呆患者认知功能的改善作用〔J〕.重庆医学，2012；41(6)：571-2，616.

7高重阳.盐酸多奈哌齐治疗血管性痴呆及对IGF-1影响的临床研究〔J〕.中风与神经疾病杂志，2012；29(3)：259-61.

8张晓红，杜双霞，卢波，等.丁苯酞联合高压氧治疗老年血管性痴呆的作用机制〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(6)：1513-5.

〔2015-08-13修回〕

(编辑李相军)