基于人胚胎干细胞的药物毒性测试替代法研究进展

贾　栗，彭 辉，赵增明，乌瀚宝栎尔，彭双清（军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心，北京 100071）

基于人胚胎干细胞的药物毒性测试替代法研究进展

贾栗，彭 辉，赵增明，乌瀚宝栎尔，彭双清
（军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心，北京 100071）

传统的药物研发及安全性评价对实验动物的需求量大，费用高，周期长，种属差异性问题难以克服。人胚胎干细胞（hESC）可自我更新及定向分化为多种类型的细胞，逐渐成为毒性测试体外替代法的新工具。hESC的体外替代模型预测受试物对人体各种靶器官的毒性及毒作用机制，如生殖毒性测试模型、神经发育毒性测试模型及体外代谢模型等，结合基因组学、蛋白质组学和代谢组学等组学技术快速高效地分析多条代谢通路，寻找潜在的毒性生物标志物。在药物毒理学研究中具有广泛的应用前景。

胚胎干细胞；毒性试验；生殖毒性；神经毒性；模型，代谢

传统的药物研发及安全性评价主要是基于动物实验，动物需求量大，费用昂贵，研发周期长，且种属差异性难以克服，而基于人源性细胞的体外替代模型逐渐引起人们的关注。人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESC）具有发育的全能性，可自我更新及定向分化为多种类型的细胞，如血细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、神经细胞、肝细胞及肾细胞等，同时可进一步诱导培养成人体特定的组织，用此可预测受试物对人体的各种靶器官毒性及毒作用机制［1］。近年来，国内外已着手将hESC应用于药物研发及药物安全性评价研究，美国国家研究委员会（National Research Council）提出的“21世纪毒性测试新策略”（Toxicity Testing in the 21st Century：a Vision and a Strategy）及欧洲委员会FP7综合工程分项“基于胚胎干细胞新法替代测试策略”（Embryonic Stem Cell-based Novel Alternative Testing Strategies）等研究项目均大力加速了基于hESC新的毒性测试技术的发展。基于hESC的毒性测试替代法可实现药物研发及安全性评价的个性化，提高药物治疗及研发的针对性，同时避免动物实验带来的种属差异，减少研发费用，缩短研发周期，是药物大规模筛选的理想手段［2］。

目前，基于hESC的毒性测试替代法的主要研究热点在于通过定向诱导hESC培养成特定类型的细胞、组织、器官等体外模型来测定候选化合物的毒性，探讨受试物可能作用的靶器官毒性和作用机制等，如肝毒性、心脏毒性、生殖发育毒性、神经毒性、免疫毒性及致癌性等；结合各种组学技术快速高效地分析多条代谢通路，有助于定位靶器官及判定毒性程度，寻找潜在的毒性生物标志物；同时考虑到未来工业化的发展，将力争实现hESC的自动化培养及其工业化的扩大生产［1］。

1　基于hESC的毒性测试体系

基于hESC的毒性测试体系相对于传统的动物实验体系能比较真实地反映药物在人体内的毒性发生发展过程，是更加安全、经济、高通量的药物筛选模型。国内外学者已利用hESC建立胚胎发育早期及神经系统发育各个阶段的毒性测试模型［2］。hESC诱导分化的神经发育毒性替代模型，可在体外模拟神经系统发育的整个生物学过程，如细胞增殖、迁移、凋亡、分化、神经突生长、突触发生、髓鞘形成及神经递质合成等［3］。此外，利用3D细胞培养技术，将hESC诱导培养成心肌细胞、肝细胞、神经管组织、内耳感觉上皮细胞等不同类型的细胞或组织，可重建体内细胞间、细胞基质间的相互作用，进一步缩小细胞水平与体内水平的差异［4-6］。

这些毒性测试体系建立之后，需要用多种阳性化合物作验证，如丙戊酸和甲基汞是目前公认的神经发育毒性化合物；同时方法/模型相应的质量标准和指导原则也需要建立与完善，以支持这些方法/模型在更多的实验室推广应用。此外，有关hESC的法规和伦理学方面的争议问题也需要建立和解决［2］。

2　基于hESC毒性测试的应用

2.1在生殖毒性评价中的应用

生殖毒性是毒性评价实验中最具技术挑战性，其周期长，费用高，使用的动物数较多，种属间外推也存在很多不确定因素。因此，急需经济、快速和准确的替代方法［7］。欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods）已通过验证的生殖发育毒性替代方法就包括ESC实验，可通过检测受试物对ESC生长分化的影响及已分化成纤维细胞活力的影响来预测受试物的胚胎毒性或致畸性，是目前唯一利用细胞系而无需怀孕动物的生殖发育毒性体外替代模型［7］。但该标准化的方法仅限于小鼠ESC，由于伦理学问题限制了hESC的进一步发展。

hESC与人类生殖发育在生理上相关。已有报道，基于hESC的模型体系可模拟男性精子发育过程，这种模型有望用于男性生殖毒性体外实验［8］。此外，Ye等［9］利用重组技术将新生小鼠子宫上皮细胞与绿色荧光蛋白标记的hESC结合，最终诱导hESC分化成女性生殖道上皮细胞。这种上皮细胞能在外雌激素的刺激下增殖并分泌子宫特有的糖蛋白-妊娠相关子宫内膜蛋白糖孕蛋白（glycodelin）A，为研究女性生殖道早期发育提供了一种新的体外模型。同时，将hESC与各种组学技术结合研究生殖发育毒性生物标志物也成为关注的焦点。Krug等［10］用甲基汞和丙戊酸作为阳性化合物检测hESC在生殖及神经发育过程中转录组学的变化，提出从转录组学变化的角度将毒性化合物分类，这种基于hESC的体外替代法可用于评价毒性效应引起的细胞蛋白质内稳态及转录水平的网络变化。但是基于hESC的体外生殖毒性检测模型依然存在许多问题，如影响配子发育关键时期的环境因素尚不清楚，实际操作和伦理问题还有待解决和完善［8］。

2.2在神经发育毒性评价中的应用

hESC可在适当的培养条件下被诱导分化成神经细胞，如神经前体细胞、各种类型的神经原和胶质细胞等。诱导ESC形成神经细胞有2个过程，先是生物物理状态的ESC聚集，形成类胚体；然后经过生物化学信号诱导，ESC就可分化为神经细胞。目前常用的诱导方法有维A酸诱导、生长因子诱导、PA6基质细胞诱导和直接分化法等［11］。而hESC作为一项体外实验方法评价神经发育毒性已备受关注。此类模型的主要优点是结构相对简单，易于检测，能检测到神经发育毒性中的细微变化。另外，还可对模型进行相应改造，如某些对神经毒物易感的基因以便进行针对性的研究［11］。

评价神经发育毒性的检测终点往往不需要用细胞死亡来判定，而更应关注神经细胞分化及通讯功能的改变［12］。Krug等［12］用人LUHMES细胞的神经突生长实验评价神经发育毒性，在40余种候选化合物中，多种化合物可抑制神经突的生长，如秋水仙碱、长春新碱、鱼藤酮和环乙酰亚胺等。而有些化合物可促进神经突的生长，如γ激酶途径的修饰物Ⅱ型肌球蛋白抑制剂（blebbistatin）或thiazovivin。这种以hESC的功能性（神经突生长）作为终点考察的实验能更加特异性地识别和描述神经毒性。Nayernia等［13］用多能干细胞诱导出人神经组织，再与恶性胶质瘤细胞共培养，2周后恶性胶质瘤细胞入侵神经组织，在体外成功模拟了体内恶性胶质瘤细胞入侵神经组织的过程，并利用此模型确定了在肿瘤细胞与神经组织的相互作用中发挥诱导或上调作用的100余个基因。Colleoni等［14］将hESC暴露于不同剂量的维A酸，将玫瑰花结形成作为形态学参数，同时结合分子参数作为检测指标来测试早期神经发育毒性。结果表明，神经花结的形成形态与维A酸暴露有明显的浓度依赖性，且与之相关的诱导基因表达变化与体内的神经管发育非常相似，证实此细胞模型可用于测试早期神经发育的致畸及毒性机制。众所周知，神经脊功能受损是引起畸形的一个重要因素。Zimmer等［15］用hESC分化出神经脊细胞，成功模拟出人神经脊细胞的迁移过程，并用已知的发育毒性化合物，如甲基汞、丙戊酸和醋酸铅等作用于该细胞模型。结果证明，该实验系统对发育毒性检测具有良好的敏感性和特异性。

hESC用于神经发育毒性体外测试方法已备受关注，但同时也有许多问题尚待完善，如缺少整体水平细胞间的相互作用、缺少毒物在体内的代谢过程以及其他一些因素（激素或免疫功能）的影响等。

2.3基于hESC的毒理基因组学和蛋白质组学

系统生物学是近10年来发展起来的一门前沿学科，包括基因组学、蛋白质组学和代谢组学。多数药物的毒性反应都涉及到DNA、RNA、蛋白质和代谢产物水平的变化及相互作用。因此，了解药物毒性作用的分子机制及作用方式非常必要。而利用各种组学技术就可从不同分子水平来检测毒性反应过程中的基因和蛋白的表达差异，可寻找出特异的毒性生物标志物，同时有助于阐明药物毒性作用机制。有学者将hESC体外暴露于不同浓度的发育毒性药物沙利度胺（反应停），利用全基因组表达谱及蛋白质图谱技术检测转录组和蛋白质组水平的变化来探讨该药的毒性作用机制。结果发现，hESC分化14 d后POU域5级转录因子1（POU domain，class 5，transcription factor 1，POU5F1）、调控蛋白M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2）和RNA结合基元蛋白（RNA binding motif protein 14，RBM14）均缺失，而与神经发育相关的p21蛋白活化激酶2（p21 protein-activated kinase 2）、血小板活化因子乙酰水合酶1b催化亚单位2（plateletactivating factor acetylhydrolase 1b，catalytic subunit 2，PAFAH1B2）和PAFAH1B3等蛋白表达上调；与四肢、心和胚胎发育相关的转录因子及生物学过程的基因组和蛋白质组表达水平均有差异，同时发现沙利度胺阻止谷胱甘肽S转移酶的基因表达，从而在细胞内水平探测沙利度胺的发育毒性机制［16］。基于hESC的这种筛选方法具有高通量、高灵敏性和高特异性等优点，且通过检测hESC分化的中间产物可筛选一些用于预测和检测药效及毒性反应的生物标志物。

2.4代谢模型

众所周知，许多化合物的毒性反应往往不是由原型药物引起的，而是由其在体内的代谢产物引起的。因此，在体外替代实验中，代谢模型一直都是关注的焦点。肝是人体新陈代谢的重要器官，用体外培养肝细胞研究药物代谢也是近年来的研究热点。近年来，人们已将hESC分化成具有一定功能的肝细胞［11］。研究表明，将hESC置于含丁酸钠的培养基中，当大部分细胞死亡后换到常规肝细胞培养基中培养剩余存活细胞，发现其中许多细胞能表达肝细胞特异性蛋白。研究表明，H1和H9 hESC分化的肝样细胞均有细胞色素p450酶活性［17］。同时，3D细胞培养技术也为hESC分化为肝细胞后体外重建肝细胞间的相互作用提供支持［11］。

但人源性肝原代细胞不易获得且增殖困难，人们开始探讨从其他细胞来源获取原代肝细胞。如Gabriel等［18］建立了一种悬浮的旋转培养系统，通过转基因技术手段，用转基因大鼠ESC选择分化出肝原代细胞。Seeliger等［19］用阿扎胞苷（5-氮杂胞苷，azacitidine）诱导脂肪间叶细胞分化出肝细胞，经验证明具有肝细胞特征。还有研究将人皮肤原代细胞中加入肝细胞生长因子培养，最终获得的肝原代细胞具有与成人肝细胞相同的一些典型特征，该模型也许可用于药物临床前的体外毒性实验［20］。

这种用于体外代谢的肝细胞也有其局限性。①在细胞3D培养过程中，一些受试物的生理生化特征会影响吸收特征，并与3D体系中的其他细胞相互作用；②新鲜分离的细胞与保存24 h的细胞会有很大的差异；③干细胞分化的肝细胞在损伤后不能像体内肝细胞那样自我调整和修复，可能是因为体外培养的肝细胞缺乏血管系统［2］。

3　展望

利用hESC构建药物安全性评价模型，可提高药物研发的针对性，减少经费，缩短研发周期，同时可避免种属差异，是药物大规模筛选的理想技术手段。虽然目前很多基于hESC毒性测试替代法还未经过完整的验证，适用性有限，但仍可用于早期的药物筛选及毒性预测。今后将继续致力于这项研究，如利用3D技术培养多能干细胞分化诱导的神经组织可广泛应用于生物医学的众多领域，可用来研究人脑的发育及恶性胶质瘤入侵的病理生理过程。hESC的自动化大规模生产也是未来努力的方向。此外，鉴定和验证hESC应答化合物引起的氧化应激的生物标志物也将是关注点之一［2］。

随着hESC技术的不断进步与完善，基于hESC毒性测试替代法研究需要多领域的共同合作来推进其迅速发展，如毒理学、ESC研究、基因组学、模型分析及自动化等。目前该项目发展的局限性在于：①已知的具有发育神经毒性的化合物较少；②需要更多的实验系统对神经发育毒性和发育毒性进行准确的分类；③需要更多高效精确的各种组学技术应用于预测毒理学分子机制及作用方式；④3D培养技术及更加复杂的长期慢性暴露毒性研究等薄弱领域需要更好的发展［2］。此外，有关hESC伦理方面的相关法律、法规应尽快出台，hESC技术标准化及相关技术方法的规范性指导原则也应建立与完善，使基于hESC的毒性测试能得到正确的引导，在未来的新药研发与安全性评价中发挥巨大的作用。

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Progress in alternative testing strategies for human embryonic stem cell-based drug toxicity

JIA Li，PENG Hui，ZHAO Zeng-ming，WUHAN Bao-lier，PENG Shuang-qing
（Evaluation and Research Center for Toxicology，Institute of Disease Control and Prevention，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China）

Traditional drug development and pre-clinical tests are based on animals and involve large numbers of animals，costs and long periods.Meanwhile，inter-species differences are difficult to overcome.Human embryonic stem cells（hESCs），which can self-renew and directly differentiate to types of cells，have become a new tool for toxicity alternative testing.hESC-Based alternative testing models，such as the reproductive toxicity test system，neuro development toxicity test system and metabolic model，can be used to predict target organ toxicity and toxic mechanisms of chemicals，analyze metabolic pathways and to search for potential toxicity biomarkers，when combined with omics such techiniques as metabonomics，proteomicsand genomics.Therefore，hESC-based alternative testing models have extensive application to toxicology.

embryonic stem cells；toxicity tests；preconception injuries；neurotoxicity；models，metabolism

The project supported by National International Scientific and Technological Cooperation Projects （2011DFA32190）

PENG Shuang-qing，E-mail：pengsq@hotmail.com，Tel：（010）66948462

R965.3

A

1000-3002-（2016）02-0173-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.013

2015-04-15接受日期：2015-08-27）

（本文编辑：齐春会）

国家国际科技合作专项项目（2011DFA32190）

贾 栗，女，硕士，实验师，主要从事药物毒理与安全性评价研究，E-mail：jiali1230@aliyun.com，Tel：（010）66948463

彭双清，E-mail：pengsq@hotmail.com，Tel：（010）66948462